Příprava rekombinantních růstových faktorů X. tropicalis a jejich charakterizace v testikulární tkáňové kultuře

Abstract

V Laboratoři vývojové biologie se podařilo založit dlouhodobou kulturu z varlat druhu Xenopus tropicalis. Obsahuje převážně pre-Sertoliho buňky, jejichž podpůrná vyživovací vrstva umožňuje kultivaci kmenových buněk, pravděpodobně sprematogoniálních. Tato diplomová práce si kladla za cíl připravit dva růstové faktory, FGF2 (fibroblast growth factor 2) a GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor), a charakterizovat jejich vliv na zmíněnou kulturu během její kultivace. Faktory byly vybrány na základě teorie o mikroenvironmentální nice, podle které se FGF2 a GDNF jeví jako nejdůležitější pro proliferaci a sebe-obnovu spermatogoniálních kmenových buněk. V rámci diplomové práce se podařilo pomocí expresního plazmidu pET-15b získat rekombinantní FGF2. Jeho charakterizace v testikulární kultuře přinesla velmi překvapivé výsledky. Pre-Sertoliho buňky v jeho přítomnosti během týdenní kultivace odumíraly. Podobný výsledek byl zatím popsán pouze u kultury diferencujících osteoblastů. Další experimenty budou muset prokázat, zda se jedná o apoptózu a proč testikulární buňky reagují tímto způsobem. Klíčová slova: Xenopus tropicalis, FGF2, GDNF, SSC, pre-Seroliho buňky

In our Laboratory of Developmental Biology there was established a long term culture derived from Xenopus tropicalis testes. It contains pre-Sertoli cells mostly. They compose a feeder layer allowing cultivation of stem cells, revealing the morphology of spermatogonial stem cells. This diploma thesis was focused on a preparation of two growth factors, FGF2 (fibroblast growth factor 2) and GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor), with the subsequent characterization of their influence at cell culture mentioned above. Factors were selected on the basis of the microenvironmental niche theory, according which FGF2 and GDNF are the most important factors for spermatogonial stem cells proliferation and self-renewal. FGF2 recombinant factor was gained using the expression plasmid pET-15b. Its characterization in the testicular culture brought surprising result. Even a low concentration of FGF2 factor (2.5ng/ml) caused cell detaching and dying. Similar result was previously shown in differentiating osteoblast culture only. More experiments need to be done to prove if apoptose take place and why do testicular cells act this way. Key words: Xenopus tropicalis, FGF2, GDNF, SSC, pre-Seroli cells