Příprava rekombinantního cytochromu P450 1A1

Abstract

4 Abstrakt Cytochrom P450 1A1 (CYP1A1) je jednou z hlavních isoforem z celé "superrodiny" cytochromů P450 (CYP). Jedná se zejména o extrahepatální enzym, který se podílí na oxidaci mnoha polycyklických aromatických uhlovodíků a jiných xenobiotik. Vedle úlohy v detoxifikačním metabolismu je bohužel CYP1A1 také jeden z nejvýznamnějších CYP v aktivaci prokarcinogenů. Cílem této práce bylo připravit pomocí genové syntézy s optimalizací kodónů pro expresi v E. coli dvě různé varianty genu kódujícího potkaní CYP1A1, tj. "wild type" (wt1A1) a s pozměněnou N-terminální kotvou (mod1A1) (u obou pak modifikace s nebo bez His kotvy na C-konci), porovnat jejich expresi v různých typech buněk E. coli a případně se pokusit o purifikaci a srovnání enzymové aktivity genových produktů. Z navržených oligonukleotidů byly syntetizovány 2 "syntony" (části genu), vloženy samostatně do plasmidu pUC19, po ověření sekvence "vyštěpeny", spojeny a vloženy do expresního plasmidu pET-22b. Takto připravenými vektory byly transformovány 3 kmeny buněk E. coli, a to BL-21 (DE3) GOLD, RIL a RIPL. Byly testovány různé podmínky produkce požadovaných proteinů: teplota (18, 22, 24, 27 a 37 řC), čas produkce (až 48 hodin), koncentrace IPTG (0,1; 0,2; 0,5 a 1mM), OD600 při indukci (0,4; 0,6; 0,8; 0,9 a 1) a přidání ALA (0, 30, 60, 120 nebo 150...

5 Abstract Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) is one of the major isoforms of the cytochrome P450 superfamily. It is primarily an extrahepatic enzyme which is responsible for oxidation of many polycyclic aromatic hydrocarbons and other xenobiotics. Besides of the role in detoxification metabolism CYP1A1 is the one most important isoform involved in activation of procarcinogens. The main aim of this project was preparation of two modifications of the rat CYP1A1 gene with codon optimization for expression in E. coli by gene synthesis. One was wild type (wt1A1) and the other was with modified N-terminal anchor (mod1A1) - for both modifications with or without His Tag at the C-end of CYP1A1. Furthermore, an aim was to compare their level of expression in different strains of E. coli and try to purify and assess enzymatic activity of the gene's products. From pre-prepared oligonucleotides 2 "syntons" (parts of gene) were synthetized and separately inserted into pUC19. After verified sequence of the "syntons" they were cleaved from pUC19 and inserted together into pET-22b. These vectors were prepared for transformation of 3 strains of E. coli (BL-21 (DE3) GOLD, RIL a RIPL). For production of proteins many conditions were tested: temperature (18, 22, 24, 27 a 37 řC), time of production (untill 48 hours), concentration...