Electron cryo-microscopy techniques in biological research and nanotechnologies

Abstract

Příprava biologických vzorků pro transmisní elektronovou mikroskopii není triviální úkol. Vzorky musí odolat vakuu přítomném v mikroskopu, a proto je často nutné uplatnit nefyziologické postupy při jejich zpracování. Tyto postupy obvykle zahrnují fixaci na bázi aldehydů, nahrazení vody alkoholem (t.j. dehydrataci/substituci), a zalití do pryskyřice, která vytváří podporu pro následnou přípravu tenkých řezů, které pak mohou být vloženy do mikroskopu. V posledním desetiletí získala dominantní postavení v oblasti výzkumu buněčné biologie metoda kryo-fixace (vitrifikace) za pomoci ultrarychlého vysokotlakého zmrazování a následná kryo-substituce a zalití vzorků do pryskyřice při nízkých teplotách. Tímto způsobem byli úspěšně vitrifikovány různé biologické vzorky s tloušťkou až několik stovek mikrometrů do stavu, který byl srovnatelný s jejich in vivo strukturou. Kryo-fixace izolovaných biologických objektů (s omezenou tloušťkou do několika mikrometrů) je možná i v tenké vrstvě vitrifikované vody za pomoci imerzní kryo-fixace při normálním tlaku. V kombinaci s kryo-elektronovou mikroskopií se tato metoda stala nejefektivnejším a základním principem pro tvorbu elektron kryo-mikroskopických obrázků plně hydratovaných vzorků s velmi vysokým rozlišením na úrovni několika desetin nanometrů. Obě tyto metody...

Preparation of biological samples for transmission electron microscopy is not a trivial task. The samples must withstand a vacuum environment present inside a microscope, and it is often necessary to use non-physiological procedures for their processing. These procedures usually involve aldehyde-based fixation, replacing water with alcohol (i.e. dehydration/substitution), and embedding into a resin, which creates support for the subsequent preparation of thin sections that can be placed into the microscope. In the last decade, the method of cryo-fixation (vitrification) using ultra-fast high-pressure freezing followed by freeze substitution and low-temperature resin embedding gained a dominant position in the cell biology research. In this way, a range of biological samples with a thicknesses up to several hundreds of micrometers was successfully vitrified to a state that was closely related to their in vivo structures. The cryo-fixation of isolated biological objects (with a limited thickness up to several micrometers) is possible in a thin layer of vitrified water by plunge freezing at ambient pressure. In combination with electron cryo-microscopy, this method has become the most effective and fundamental principle for the high-resolution studies and image analysis of fully hydrated samples...