Identifikace genů nezbytně nutných pro normální průběh oplození a preimplantačního vývoje skotu v podmínkách in vitro

Abstract

The aim of this work was to find and characterize genes that seem to be important for normal preimplantation development. We characterized three genes in more detail - centromeric protein F (CENPF; mitosin), ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 (UCHL1) and nucleophosmin (NPM1; B23; numatrin; NO38). CENPF and nucleophosmin were shown to start their expression at late 8-cell stage, i.e. at major embryonic genome activation (EGA), and were hence supposed to be important during bovine preimplantation development. CENPF plays crucial role during cell division, especially by mediating the interaction of kinetochores and microtubules. Nucleophosmin is a multifunctional nucleolar phosphoprotein, whose most important roles are rRNA processing, chaperoning, ribosome biogenesis and centriole duplication control. Further, we characterized the role of UCHL1 during fertilization of bovine oocytes. UCHL1 is a deubiquitinating enzyme that controls cytoplasmic protein degradation, recycling of free ubiquitin from proteasome products and is involved in regulation of physiological apoptosis. We studied the function of CENPF and nucleophosmin using RNA interference approach. Since UCHL1 protein is very stable, this method is not suitable for studying the UCHL1 function. We thus used two UCHL1 inhibitors that block its...

Cílem této práce bylo nalézt a charakterizovat geny, které jsou potenciálně nezbytné pro normální preimplantační vývoj. Podrobněji jsme charakterizovali tři geny - CENPF (centromeric protein F; mitosin), UCHL1 (ubiquitin C-terminal hydrolase-L1) a nukleofosmin (NPM1, B23, numatrin; NO38). Embryonální transkripce CENPF a nukleofosminu je aktivována v pozdním 8-buněčném stádiu (tj. v době embryonální genomové aktivace - EGA), a proto lze předpokládat, že jsou pro normální preimplantační vývoj nezbytné. CENPF je důležitý pro buněčné dělení, především zprostředkuje interakci mezi kinetochorem a mikrotubuly. Nukleofosmin je multifunkční jadérkový fosfoprotein, který se podílí zejména zpracováni rRNA, biogenezi ribozómů, duplikaci centriol a uplatňuje se také jako chaperon. Dále jsme na základě předpokládané úlohy během fertilizace vybrali gen UCHL1 a popsali jeho úlohu během oplození bovinních oocytů. UCHL1 je deubikvitinylační enzym, který koordinuje degradaci cytoplazmatických proteinů, recyklaci volného ubikvitinu z proteazomu a podílí se na regulaci fyziologické apoptózy. Úlohu CENPF a nukleofosminu jsme sledovali pomocí RNA interference (RNAi). Protein UCHL1 je velmi stabilní, a proto není pro jeho studium RNAi vhodná. Místo toho jsme využili dvou UCHL1 specifických inhibitorů, které inhibují jeho...