Nová proteáza v redukovaných mitochondriích Giardia intestinalis.

Abstract

Proteom mitosomů lidského patogena Giardia intestinalis je v současnosti reprezentován méně než dvaceti proteiny, které jsou importovány z cytoplasmy, kompletně totiž chybí mitochondriální genom. N-koncové sekvence, které zacilují tyto proteiny do mitosomů jsou podobně jako v "klasických" mitochondriích, uvnitř organel odštěpeny specifickými peptidázami a zbylý protein tak může nabýt nativní konformace. Ze tří hlavních typů mitochondriálních peptidáz je v mitosomech G. intestinalis přítomna pouze funkční polovina enzymu MPP, což je situace naprosto unikátní v celé eukaryotické říši. Na základě proteomické analýzy jsme v mitosomech identifikovali novou peptidázu (Peptidáza X) a nyní se pokoušíme o její detailnější charakteristiku. Pomocí overexprese s hemaglutininovým tagem byla ověřena mitosomální lokalizace proteinu a dále byla charakterizována přesná distribuce proteinu do mitosomálních subkompartmentů pomocí specifické protilátky. Za použití sodium karbonátové extrakce byla zjištěna membránová lokalizace Peptidázy X. Pomocí protease protection assay se nám podařilo zjistit, že protein je zakotven ve vnitřní mitosomální membráně a exponován do mitosomální matrix. Samotná Peptidáza X nese na N-konci mitochondriální targetovací sekvenci, která je schopna zajistit transport proteinu do kvasinkové...

The proteom of Giardia mitosomes is represented by twenty proteins, which are imported from the cytoplasm, as mitochondrial genome is missing. The N-terminal sequences, which target proteins to mitosomes are removed upon translocation and the remaining protein is folded into its native comformation. Out of three types of mitochondrial processing peptidases only functional half of dominant matrix peptidase is present in the mitosomes of G. intestinalis - feature unique among all eukaryotes. Based on the proteomic analyses, we identified novel putative mitochondrial peptidase (peptidase X) in G. intestinalis mitosomes. Overexpressing the protein with hemagglutinin tag we confirmed its mitosomal localization. Using specific polyclonal antibody combined with carbonate extraction and protease protection assay we have specified the distribution of the protein in the mitosomal subcompartments. Based on these results, peptidase X is anchored in the inner mitosomal mambrane via its C-terminus facing the mitosomal matrix. Peptidase X has mitochondrial targeting sekvence on the N-terminus, which is also capable of targeting protein into yeast mitochondria. By using bioinformatic tools, we are trying to detect structural similarities of peptidase X to other proteins in order to identify its substrate specifity and thus...