Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C1

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Iva Vomočilová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C1 Práce je zaměřena na syntézu lidského proteinu AKR1C1. Kódová sekvence pro tento protein byla objednána v podobě cDNA, která byla vložena do plazmidu pOTB7. Dodané buňky Escherichia coli, nesoucí takto upravený plazmid, byly namnoženy a plazmid byl purifikován pomocí alkalické lýzy. S purifikovaným plazmidem byla provedena polymerasová řetězová reakce s dvojicí navržených primerů, které obsahovaly restrikční místo. S ohledem na potřeby pozdějších reakcí byla zvolena rozpoznávací místa pro restrikční endonukleasy NdeI a XhoI. Pro ověření kvality purifikace plazmidu a úspěšnosti PCR byla použita horizontální elektroforéza. Produkt PCR byl purifikován s využitím elektroforézy na ultra-čisté agaróze. Jako vektor byl zvolen plazmid pET-28b(+). Ten byl namnožen v předem upravených buňkách E. coli HB101 a následně purifikován. Purifikovaný plazmid a purifikovaný produkt PCR byly štěpeny pomocí restrikčních endonukleas XhoI a NdeI. Oba naštěpené úseky byly přečištěny a s využitím T4 DNA ligasy byl fragment PCR vložen do otevřeného vektoru pET-28b(+). Takto upravený plazmid byl...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Iva Vomočilová Supervisor: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Title of diploma thesis: Cloning, expression and purification of human AKR1C1 This work is focused on synthesis of human AKR1C1. AKR1C1 coding sequence (cDNA), incorporated into plasmid pOTB7, was purchased and delivered in Escherichia coli cells. These cells with modified plasmid were multiplied in LB medium. After the multiplication plasmid was isolated and purified by the alkaline lysis process. Coding sequence for AKR1C1 was amplified by PCR method. The primers were designed in advance and contained restriction sites for XhoI and NdeI endonucleases. The results of PCR were validated by gel electrophoresis. Then the PCR product was purified on ultra-pure agarose gel. In the next step plasmid pET-28b(+) was used to insert prepared coding sequence. Plasmid was multiplied in competent cells E. coli HB101 and purified by the alkaline lysis process. Purified PCR fragment and plasmid were double digested by a pair of restriction endonucleases mentioned above. These digested fragments were purified and PCR fragment was put into the open vector pET-28b(+) by T4 DNA ligase enzyme. This modified plasmid was transferred into the...