Příprava vektorů pro heterologní expresi lidského cytochromu P450 1B1

Abstract

Laboratoř molekulární karcinogeneze a vývoje léčiv, pod jejíž záštitou byl tento projekt vypracován, se problematikou cytochromů P450 zabývá již delší dobu. Tyto enzymy se podílejí v drtivé většině na první fázi biotransformace jak xenobiotik, tak endogenních látek, méně často pak na syntéze např. látek steroidní povahy. Práce se zabývá přípravou expresních vektorů založených na plasmidu pET-22b, vhodných pro přípravu lidské formy cytochromu P450 1B1 metodou heterologní exprese. Tento cytochrom P450 je přítomný v endoplasmatickém retikulu především extrahepatálních tkáních a jeho exprese je navíc indukována dioxiny a polycyklickými aromatickými uhlovodíky. K přípravě vektoru byl použit gen pro lidský cytochrom P450 1B1, který byl pomocí metody PCR upraven. Na oba konce genu byla přidána štěpící místa pro restrikční endonukleasy a v jednom případě také úsek kódující histidinovou kotvu pro snadnější izolaci enzymu. Pomocí agarosové elektroforesy byl jak insert, tak štěpený plasmid verifikován a zároveň také purifikován k ligaci a následné transformaci konstruktu do kompetentních buněk E. coli DH5. Klíčová slova: cytochrom P450 1B1, karcinogeneze, plasmid, heterologní exprese

The thesis was worked out in Laboratory of Molecular Carcinogenesis and Drug Development, which is focus on study of drug metabolizing enzymes including cytochromes P450. Cytochromes P450 are participating at initial phase of biotransformation of xenobiotics and endogenous substances and metabolism of several endogenous compounds, i.e. steroids. This work is focused on construction of expression vectors, based on the plasmid pET- 22b, suitable for heterologous expression of the human cytochrome P450 1B1. This enzyme is predominantly present in the endoplasmic reticulum of extra-hepatic tissues and its expression is induced by dioxins and polycyclic aromatic hydrocarbons. The human gene for cytochrome P450 1B1 was modified using PCR. The cleavage sites for restriction endonucleases were added to both ends of the gene. Another construct also contained N-terminal histidine tag to facilitate easier purification of the enzyme. Both insert and digested plasmids were verified using the agarose electrophoresis and used for ligation and transformation into competent cells (E. coli DH5. Final steps in construction was, however, not successful, probably due to low yields of DNA fragment extraction from agarose gels. Key words: cytochrome P450 1B1, carcinogenesis, plasmid, heterologous expression [In Czech]