Heterologní exprese NADPH:cytochrom P450 reduktasy

Abstract

NADPH:cytochrom P450 reduktasa (CPR) je flavoprotein o velikosti 78 kDa, který je spolu s cytochromy P450 součástí monooxygenasového systému vázaného v membráně endoplasmatického retikula. Monooxygenasový systém se účastní metabolizmu široké škály organických látek, včetně léčiv nebo různých polutantů přítomných v životním prostředí (polycyklické aromatické uhlovodíky, aromatické aminy aj.). CPR funguje jako přenašeč redukčních ekvivalentů z NADPH na příslušné cytochromy P450. Pro správnou interakci s cytochromy P450 je důležitá N-terminální hydrofobní doména kotvící protein v membráně. Odstranění této domény, např. trypsinovou proteolýzou, má za následek vznik solubilní CPR (72 kDa) a ztrátu katalytické aktivity vůči cytochromu P450. V průběhu heterologní exprese v bakteriích E. coli je proteolyticky labilní místo CPR (Lys56 - Ile57) cílem působení intracelulárních proteas s trypsinovou aktivitou, což může negativně ovlivnit výtěžky nativního 78 kDa proteinu. Předkládaná diplomová práce popisuje heterologní expresi, purifikaci a charakterizaci dvou forem potkaní CPR. Forma wtCPR představuje protein přirozeně se vyskytující v potkaním organismu (kmen Wistar), zatímco mCPR obsahuje aminokyselinovou substituci (K56Q) v místě proteolytické degradace. Výsledkem zmíněné substituce je proteolyticky...

NADPH:cytochrome P450 reductase (CPR) is a 78 kDa flavoprotein, which is together with cytochrome P450 component of monooxygenase system bound in the membrane of the endoplasmic reticulum. Monooxygenase system is involved in the metabolism of a wide range of organic substances, including drugs or various pollutants present in the environment (polycyclic aromatic hydrocarbons, aromatic amines, etc.). CPR works as a transporter of reducing equivalents from NADPH to the cytochromes P450. For proper interaction with cytochromes P450, intact N-terminal hydrophobic domain anchoring protein in the membrane is needed. Removing this domain, e.g. during trypsin proteolysis, gives rise a soluble CPR (72 kDa) and cause loss of catalytic activity towards cytochrome P450. During heterologous expression in E. coli proteolytically sensitive site of CPR (Lys56 - Ile57) is cleaved by intracellular trypsin-like proteases, that may negatively affect the yields of native 78 kDa protein. This thesis describes the heterologous expression, purification and characterization of two forms of rat CPR. WtCPR is a protein naturally occurring in rats (Wistar strain), while mCPR contains one amino acid substitution (K56Q) in the site of proteolytic degradation. The result of that substitution is proteolytically stable CPR,...