Připrava slepičích protilátek proti fosfoserinovym zbytkům fosfoproteinu

Abstract

Byl připraven nový typ imunogenu pro přípravu slepičích protilátek specifických pro O-fosforylované aminokyselinové zbytky fosfoproteinů: směs fosfopeptidů α-kaseinu imobilizovaná na maleylovaný derivát hovězího serového albuminu. Pro separaci fosfopeptidů α-kaseinu ze směsi peptidů po štěpení proteinu trypsinem byla použita afinitní chromatografie na imobilizovaných železitých iontech (Fe(III)-IDA-Sepharosa). Separovaná frakce fosfopeptidů α-kaseinu byla navázána na maleylovaný derivát hovězího seérového albuminu. Přítomnost navázaných fosfopeptidů byla prokázána pomocí MALDI-TOF MS analýzy. Po imunizaci slepic připraveným imunogenem, byla ze žloutků izolována imunoglobulinová frakce, která dále byla purifikována pomocí afinitní chromatografie na α-kasein-Sepharose a na hovězím sérovém albuminu imobilizovaném na Sepharose (BSA-Sepharosa). Specifita získaných protilátek byla testována pomocí ELISA testů. Bylo zjištěno, že připravené slepičí protilátky, ani jejich frakce po afinitní chromatografii na α-kasein-Sepharose O-fosforyl-O- serinový zbytek v modelových fosfoproteinech (α-kasein, fosvitin, ovalbumin) nerozpoznávají. Pomocí synteticky připravených antigenů bylo prokázáno, že slepičí protilátky připravené imunizací antigenem vázaným na maleylovaný nosný protein rozpoznávají přítomnost...

New type of immunogen for the preparation of chicken antibodies specific for O- phosphorylated amino acid residues of phosphoproteins was prepared: the α-casein phosphopeptide mixture was coupled to maleinylated derivative of bovine serum albumin. Affinity chromatography on immobilized Fe(III) ions (Fe(III)-IDA-Sepharose) was used for the separation of the α-casein phosphopeptide fraction from the α-casein peptide mixture obtained by the proteolytic digestion using trypsin. The presence of coupled phosphopeptide was shown by means of MALDI-TOF MS analysis. After chicken immunisaion with the prepared immunogen the immunoglobulin fraction was isolated from egg yolks that was further purified using affinity chromatography on α-casein-Sepharose and bovine serum albumin immobilized on Sepharose (BSA-Sepharose). The specificity of obtaine immunoglobulin fractions was tested by means of ELISA tests. The obtained results showed, that the prepared chicken antibodies and their fractions obtained by affinity chromatography on α-casein-Sepharose do not recognize the O-fosforyl-L-serine residues of phosphoproteins (α-casein, phosvitin, ovalbumin). Using the prepared different antigens it has been shown, that prepared chicken antibodies interact with maleinylated chain coupled to carrier proteins. .