Charakterizace nízkomolekulárních syntetických markerů izoelektrických bodů kapilární zónovou elektroforézou a kapilární izoelektrickou fokusací

Abstract

Vysokoúčinné elektromigrační separační metody, kapilární zónová elektroforéza (CZE) a kapilární izoelektrická fokusace (CIEF), byly použity pro fyzikálně-chemickou charakterizaci nově syntetizovaných nízkomolekulárních markerů izoelektrických bodů. Amfoterní sloučeniny na bázi aminomethylnitrofenolů, jejich derivátů a jiných strukturně příbuzných látek byly analyzovány metodou CZE v sérii základních elektrolytů v širokém rozmezí pH 1,86 - 11,18. Ze změřené závislosti efektivních elektroforetických pohyblivostí analytů na pH (předem korigovaných na referenční teplotu 25řC) byly odečteny jejich izoelektrické body (pI) a nelineární regresní analýzou byly u vybraných látek určeny acidobazické disociační konstanty jejich ionogenních skupin (pKa). Analyty s ostře definovanými izoelektrickými body byly následně analyzovány metodou CIEF, kterou byla prokázána použitelnost těchto analytů jako markerů izoelektrických bodů pro kalibraci pH gradientu v CIEF při určování pI amfoterních látek, zejména peptidů a bílkovin. Stanovené hodnoty pKa ionogenních skupin vybraných sloučenin budou využity při vývoji nových markerů izoelektrických bodů s požadovanými hodnotami pI.

High-performance electromigration separation methods, capillary zone electrophoresis (CZE) and capillary isoelectric focusing (CIEF), have been applied to physico-chemical characterization of new synthetic low-molecular mass markers of isoelectric points. Amphoteric compounds on the basis of aminomethylnitrophenols, their derivatives and other structurally related substances were analyzed by CZE in a series of background electrolytes in a wide pH range, 1.86 - 11.18. From the measured pH dependencies of effective electrophoretic mobilities of analytes (beforehand corrected to reference temperature of 25 řC), their isoelectric points (pI) were determined. In addition, using the non-linear regression analysis of the above dependencies, acid-base dissociation constants (pKa) of ionogenic groups of selected analytes were calculated. Subsequently, the analytes with sharply defined isoelectric points were analyzed by CIEF. CIEF confirmed applicability of these compounds as markers of isoelectric points for calibration of pH gradient in CIEF in the determination of pI of amphoteric compounds, especially peptides and proteins. The determined pKa values of ionogenic groups in particular compounds will be utilized in the development of new pI markers with desired pI values.