Studium mechanismu posttranskripčního a transkripčního umlčování transgenů v buněčné linii tabáku BY-2

Abstract

RNA interference je jedním z mechanismů, který umožňuje buňkám regulovat aktivitu genů, ovlivňovat tvorbu a udržování heterochromatinu a chránit je před invazivními nukleovými kyselinami. U rostlin je RNA interference spouštěna přítomností dvoušroubovicové RNA, která je štěpena proteinem Dicer na malé RNA o délce převážně 20-24nt. Tyto malé RNA mohou v komplexu s proteinem Argonaut na základě sekvenční komplementarity řídit štěpení mRNA, blokování translace, či modifikace chromatinu. V důsledku tak může být genová exprese umlčována buď posttranskripčně (tím že je bráněno vzniku proteinu z již vytvořené mRNA, PTGS) a nebo transkripčně (tím že je bráněno vzniku transkriptu, TGS). Záměrem této práce bylo připravení různých způsobů spouštění posttranskripčního umlčování a porovnání jejich funkčnosti a účinnosti. Dalším krokem pak byla příprava systému, který by měl umožnit sledování jednotlivých kroků přechodu posttranskripčního umlčování na umlčování transkripční. Tyto tzv. indikátorové linie by měly dovolit sledovat časování a dynamiku tohoto procesu s využitím fluorescenčních proteinů. Připravovaný systém umožní také vyhodnocení různých faktorů na průběh tohoto procesu - jedním z nich je RNA-dependentní RNA polymeráza 6, která hraje hlavní roli v samovolném spouštění PTGS. V práci je použita jako modelový...

The RNA interference is a mechanism, which allows cells to regulate their genes functions, to establish and maintain heterochromatin and to defend them against invasive nucleic acids. In plants, RNA interference is initiated by double-stranded RNA, which is processed by Dicer into small RNAs, usually 20-24nt long. These small RNAs form a complex with Argonaut protein that participates in different processes based on sequence complementarity. This complex can guide mRNA cleavage, translation blocking and chromatin modifications, resulting either into posttranscriptional silencing (by preventing translation of already existing mRNA, PTGS) or transcriptional silencing (by preventing transcription of mRNA, TGS). The first step of this thesis was to establish different ways of triggering PTGS and to evaluate their functionality and efficiency. The next step was a preparation of a system which would allow to study the transition from posttrancriptional to transcriptional silencing. These so called "indicator lines" should allow to observe the timing and dynamics of this process by utilizing fluorescent proteins. This system is also going to enable to evaluate, how different factors are involved in this process - one of the factors is RNA-dependent RNA polymerase 6 (RDR6) which plays an essential role in...