Separace a stanovení možných produktů enzymového štěpení 4-nitrofenyl-N,N'-diacetyl-β-D-chitobiosidu pomocí kapilární elektroforézy

Abstract

Tato práce se zabývá vývojem a optimalizací podmínek metody, kterou lze využít k porovnání aktivity enzymu β-N-acetylhexosaminidasy při hydrolýze jejího přirozeného substrátu a tvz. chromogenního substrátu, který se často využívá při studiu enzymové kinetiky. Jako substrát pro štěpení byl zvolen 4-nitrofenyl-N,N'-diacetyl-β- D-chitobiosid. Tento oligosacharid obsahuje vazbu, kterou enzym štěpí v přirozeném substrátu, a zároveň také vazbu, která se vyskytuje v substrátu chromogenním. Pro stanovení produktů, jež vznikají při enzymatické hydrolýze 4-nitrofenyl-N,N'-diacetyl- β-D-chitobiosidu byla využita kapilární zónová elektroforéza. Nejprve bylo nutno najít optimální složení základního elektrolytu, tedy jeho hodnotu pH a koncentraci. Optimálním základním elektrolytem byl roztok tetraboritanu sodného o koncentraci 25 mmol/l a hodnotě pH 10,25. Následně byla zjištěna opakovatelnost měření, kalibrační závislosti a linearita, limit detekce a limit kvantifikace. Opakovatelnost migračních časů se pohybovala do 0,6%, opakovatelnost plochy píků pak v rozmezí 2,5 až 6,3%. Limity detekce metody byly v rozmezí 0,005-0,120 mmol/l. Nakonec byla optimalizovaná metoda úspěšně použita ke sledování průběhu skutečného enzymového štěpení.

This work deals with the development and optimization of conditions of a method that can be used to compare the activity of the enzyme β-N-acetylhexosaminidase in hydrolysis of a natural substrate and a chromogenic substrate, which is often used in the study of enzyme kinetics. As a substrate, 4-nitrophenyl-N,N'-diacetyl-β-D-chitobioside was selected for cleavage. This oligosaccharide contains bond, which the enzyme cleaves in the natural substrate, and the bond that occurs in the chromogenic substrate. To determine the products arising from enzymatic hydrolysis of 4-nitrophenyl-N,N'-diacetyl-β-D-chitobioside, capillary zone electrophoresis was used. First, it was necessary to find the optimal composition of the electrolyte, its pH and concentration. The optimal background electrolyte was a solution of sodium tetraborate at a concentration of 25 mmol/l and a pH of 10.25. Subsequently, repeatability, calibration curves and linearity, limit of detection and limit of quantification were investigated. Repeatability of migration times ranged up to 0.6%, the repeatability of peak areas between 2.5 and 6.3%. Limits of detection were ranging from 0.005 to 0.120 mmol/l. Finally, the optimized method was successfully used to monitor the actual enzyme cleavage.