Syntéza 5'-UTR varianty PSM-E genu GCPII jako standardu pro RT-PCR

Abstract

V poslední době se pro chemickou syntézu genů stala klíčovým prvkem metoda PCR. V této práci byla využita dvoukroková syntéza DNA založená na PCR k získání 5'-UTR sestřihové varianty PSM-E glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) jako standardu pro qPCR v reálném čase. Dalším cílem práce bylo zaklonovat tuto sekvenci do plazmidu PCRII-TOPO PSM-E, aby mohla být použita k expresi proteinu v hmyzích buňkách v baculovirovém expresním systému. V první PCR reakci byl syntetizován střed sekvence 5'- UTR, který byl následně amplifikován v druhé PCR reakci pomocí prvního a posledního oligonukleotidu. Produkt druhé PCR reakce byl ligován do plasmidu pUC19 a tímto kostruktem byly transformovány bakterie E. coli. Správnost sekvence byla potvrzena sekvenční analýzou. Dále bylo provedeno subklonování insertu z pUC19 do pCRII-TOPO PSM-E a sekvence byla opět ověřena sekvenční analýzou. Získaný konstrukt byl použit jako standard v qPCR v reálném čase ke stanovení koncentrace vzorků mRNA z tkání prostat onkologických pacientů přepsaných reverzní transkripcí do cDNA. Z naměřených amplifikačních křivek standardu byla vytvořena kalibrační křivka, ze které byly odečteny hodnoty koncentrací vzorků cDNA.

PCR method has recently become a key element for the syntesis of genes. In this work two-step DNA synthesis based on PCR was used in order to obtain 5'-UTR of the PSM-E splicing variant of glutamate carboxypeptidase II (GCPII) which should serve as a standard for qPCR in real time. Another aim of this work was to clone this sequence into the plasmid PCRII-TOPO PSM-E for the purpose of protein expression in insect cells in the baculovirus expression system. In the first PCR the middle section of the 5'-UTR sequence was synthesized. This product was subsequently amplified in the second PCR using the first and last oligonucleotide. The product of the second PCR was ligated into the plasmid pUC19 and E. coli was transformed by tis construct. Sequence correctness was confirmed by sequencing analysis. Subcloning of the insert from pUC19 to pCRII-TOPO PSM-E was carried out and the sequence was checked by sequencing analysis again. The obtained construct was used as a standard in qPCR in real time in order to determine the concentration of the samples of mRNA from the prostate tissues of oncologic patients