Enviromentální DNA-nevyčerpatelný zdroj unikátních bakteriálních genů

Abstract

Enzymologický výzkum se v současné době zaměřuje na hledání variant známých enzymů s pozměněnými vlastnostmi či zcela nových katalyticky účinných proteinů. Klasický přístup vyhledávání nových genů založený na kultivaci mikroorganismů však selhává u environmentálních vzorků, neboť je tvoří zejména nekultivovatelné mikroorganismy. Proto byl vyvinut nový tzv. "metagenomický" přístup umožňující přímou komplexní analýzu mikrobiálních populací, který spočívá v izolaci celkové DNA (RNA) z daného prostředí a její následné sekvenční (genotypové) či funkční (fenotypové) analýze. V této práci byl aplikován metagenomický přístup při hledání nových variant penicilin-G-acylasy, enzymu katalyzujícího hydrolysu, resp. tvorbu vazby acylu na β-laktamové jádro a uplatňujícího se při výrobě polosyntetických β-laktamových antiobiotik, v jedenácti vzorcích odpovídajících 4,5 m půdnímu horizontu. Pomocí sekvenční analýzy PCR amplikonů získaných na metagenomických templátech byly získány nukleotidové sekvence podstatné části potenciálních strukturních penicilinacylasových genů vykazujících po překladu nejvyšší stupeň homologie s penicilinamidasou z Conexibacter woesei. Pokračováním této metagenomické studie bude amplifikace alespoň jednoho kompletního strukturního genu pro environmentální penicilinacylasu, avšak klonované...

Search for new enzymes or variants of known ones is now a hot issue in enzymological research. The classical culture-based approach, however, often fails when applied on environmental samples, because they contain uncultured microorganisms at most. For this reason, a new approach has been developed - the metagenomics. This approach is based on direct isolation of total DNA (RNA) from specific environment and its subsequent sequence-based (genotype) or function-based (phenotype) analysis. In this work, the metagenomic approach has been used to find new forms of penicillin G acylase, the enzyme that catalyze cleavage or formation of acyl - β-lactam nucleus bond and is used in industry for synthesis of semi-synthetic β-lactam antibiotics, in eleven samples from 4.5 m soil horizon. Sequence analysis of PCR amplicons on metagenomic templates revealed nucleotide sequences of major part of potential structural penicillin acylase genes. After translation it has been found that the sequences are most homologous to penicillin amidase from Conexibacter woesei. Further perspective of this metagenomic study is amplification of at least one complete structural gene of environmental penicillin acylase. However, the cloned regions of the gene can also be used to create hybrid penicillin acylases using gene shuffling...