Heterologní exprese lidské NADPH:cytochrom P450 reduktasy

Abstract

Se studiem karcinogenese přímo souvisí studium metabolismu xenobiotik, neboť ta se mohou na vzniku rakoviny podílet. Systém monooxygenas se smíšenou funkcí, který se na odbourávání cizorodých látek významně podílí, je v laboratoři, v níž byla práce prováděna, studován především pomocí experimentů in vitro. Pro získání potřebných rekombinantních enzymů se v současnosti hojně využívá metoda heterologní exprese. V této práci byla tato metoda použita pro přípravu lidské NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasy, membránového enzymu, který redukuje cytochrom P450 a tím umožňuje jeho katalytickou aktivitu. Byly připraveny a ověřeny vektory, nesoucí syntetický gen pro lidskou NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasu, založené na plasmidech pUC19 a pET22b. Reduktasa byla produkována v buňkách E. coli BL21-Gold a E. coli BL21-CodonPlus-RIL. Celková produkce proteinu v buňkách byla vysoká, problémem však bylo, že vznikající protein byl přítomen převážně v inkluzních tělískách. Byly částečně optimalizovány podmínky exprese tak, aby zvětšil podíl nativního proteinu v bakteriální membránové frakci.

Study of carcinogenesis is associated with study of xenobiotics metabolism, which is topic studied in our laboratory. Mixed-function oxygenase system (MFO system) is significantly contributing to the metabolism of xenobiotics. Pure recombinant proteins participating in MFO system are frequently utilized in in vitro metabolic experiments. The heterologous expression method is often used to obtain the pure recombinant enzymes. Heterologous expression was employed to prepare human NADPH:cytochrome P450 oxidoreductase. This membrane enzyme reduces cytochrome P450 and enables its catalytic activity. Vectors with synthetic gene for human NADPH:cytochrome P450 oxidoreductase based on pUC19 and pET22b plasmids were prepared and verified. Recombinant protein was produced in E. coli BL21-Gold and E. coli BL21-CodonPlus-RIL cells. Both cell strains produced high levels of the protein; however the major part of the protein was present predominantly in inclusion bodies. Expression conditions were therefore optimized to obtain higher yields of native protein bound in bacterial membrane fraction. [In Czech]