Variabilita exprese a umlčování transgenů v rostlinách bramboru a v buněčné linii tabáku BY-2

Abstract

Conclusions In suspension cultures of tobacco BY-2 cell line derived from calli after transformation about 90 % of lines contained cells with various GFP fluorescence level after transformation. Newly introduced cloning method allowed obtaining nearly 50 % of clones with homogeneous GFP expression from primarily heterogeneous BY-2 lines. Heterogeneity of GFP expression in transgenic BY-2 lines had two causes - genetic (primary lines contained cells with different T-DNA insertions) and epigenetic one. Epigenetic heterogeneity of BY-2 lines was connected with transgene silencing, formation of stable epigenetic states early after transformation, and "permanent heterogeneity" with fluctuating levels in GFP expression. Reduction or silencing of transgene expression in potato was predominantly observed in lines with higher number of T-DNA insertions and with higher initial GFP expression. Silencing in potato always gradually affected both introduced genes. Silencing of GFP expression preceded (in months) loss of resistance to kanamycin (silencing of NPTII gene) in all monitored cases that indicates interconnections between silencing of both transgenes. The same sequence of silencing of both transgenes in potato was also observed in silenced lines after reactivation of transgene expression by 5-azacytidine, which...

Závěry U suspenzních kultur buněčné linie tabáku BY-2 odvozených z kalusů po transformaci bylo po transformaci téměř 90 % linií tvořeno buňkami s různou mírou fluorescence GFP. Nově zavedená metoda klonování umožnila získání téměř poloviny klonů s homogenní expresí GFP z primárně heterogenních linií BY-2. Heterogenita exprese GFP u transgenních linií BY-2 měla původ jednak genetický (primární linie obsahovaly buňky s různými inzercemi T-DNA) a jednak epigenetický. Epigenetická heterogenita linií BY-2 souvisela s umlčováním transgenů, tvorbou stabilních epigenetických stavů brzy po transformaci a "permanentní heterogenitou" projevující se kolísavými změnami v expresi GFP. Snížení nebo umlčení exprese transgenů u bramboru bylo pozorováno přednostně u linií s vyšším počtem insercí T-DNA a s vyšší počáteční expresí GFP. Umlčení vždy postupně postihlo oba vnesené geny, přičemž vymizení exprese GFP předcházelo (v řádu měsíců) ve všech sledovaných případech ztrátě rezistence ke kanamycinu (umlčení genu NPTII), což naznačuje vzájemné propojení mezi umlčováním obou transgenů. Stejná posloupnost v umlčení obou transgenů byla také pozorována u umlčených linií po obnovení exprese transgenů 5-azacytidinem, který způsobuje demetylaci DNA. Byl navržen možný mechanismus postupného umlčování transgenů v rámci celých rostlin...