Charakterizace rekombinantního fragmentu protilátky proti znaku CD3

Abstract

Monoklonální protilátka MEM-57 rozpoznává antigen CD3, exprimovaný na T-lymfocytech periferní krve. Komplex membránových glykoproteinů CD3 asociuje s receptorem T-buněk a je zodpovědný za přenos aktivačního signálu. Protilátka MEM-57 má proto výrazný diagnostický a terapeutický potenciál. Mohla by být využita v diagnostice autoimunitních onemocnění, při klasifikaci T-buněčných leukemií nebo jako imunosupresivum při transplantacích. Nejslibnějším terapeutickým využitím protilátky MEM-57 by však byla konstrukce protilátkového fragmentu ve formátu BiTE (z angl. bispecific T-cell engager) pro léčbu rakoviny. Při konstrukci tohoto protilátkového formátu by byl jednořetězcový variabilní fragment protilátky MEM-57 (scFv, z angl. single-chain fragment, variable) spojen v jedné molekule s fragmentem scFv protilátky proti nádorovému antigenu. Tato práce je zaměřena na charakterizaci rekombinantního fragmentu scFv protilátky MEM-57. K heterologní expresi byl použit kmen E. coli BL21 (DE3) a vektor pET22b(+) kódující sekvenci pelB pro akumulaci produktu v periplasmatickém prostoru, vlastní rekombinantní protilátkový fragment scFv MEM-57, epitop c-myc a histidinovou kotvu. Byl vypracován dvoukrokový purifikační protokol zahrnující chelatační a ionexovou chromatografii, který poskytuje dostatečné množství...

Monoclonal antibody MEM-57 recognizes CD3 antigen expressed on peripheral blood T-lymphocytes. CD3 surface glycoprotein complex associates with T-cell receptor and is responsible for the transduction of activation signal. Antibody MEM-57 has, therefore, a large diagnostic and therapeutic potential. It could be used in autoimmune diseases diagnostics, for classification of T-cell leukemias and, as an immunosuppressant, in transplantation. The most promising therapeutic use of MEM-57 antibody would be the construction of a "Bispecific T-cell Engager" (BiTE) antibody format with potential application in cancer therapy. In this format, single-chain variable fragment (scFv) of MEM-57 would be fused with an anti-tumor antigen scFv. The thesis is focused on biochemical and biophysical characterization of MEM-57 antibody scFv fragment. Recombinant antibody fragment scFv MEM-57, equipped with the pelB leader sequence, c-myc tag and His5 tag, was produced from a pET22b(+) vector into the periplasmic space of E. coli BL21 (DE3). Two-step purification protocol, employing nickel chelation affinity chromatography and ion-exchange chromatography, was developed to obtain high yield of pure protein. The antigen binding activity of scFv MEM-57 was confirmed by flow cytometry. Structural information on scFv MEM-57...