Příprava rekombinantního lidského cytochromu b5

Abstract

Cytochrom b5 je malý hemový protein. V lidském organismu se vyskytuje ve třech formách, a to vázaný v membráně endoplasmatického retikula (mikrosomální cyt b5) nebo ve vnější mitochondriální membráně, ale také jako solubilní forma v cytoplasmě maturovaných erytrocytů. Cytochrom b5 slouží zejména jako jednoelektronový přenašeč při různých reakcích, včetně reakcí katalyzovaných cytochromy P450. Jedním z cílů předkládané diplomové práce bylo připravit a izolovat solubilní králičí cytochrom b5, a to metodou heterologní exprese v Escherichia coli BL 21 Gold. Pro expresi byl použit expresní vektor založený na plasmidu pET22b, který nesl syntetický gen kódující králičí mikrosomální cytochrom b5, u něhož byla odstraněna část kódující C-terminální membránovou kotvu. Dále byly syntetizovány geny kódující lidský erytrocytární a mikrosomální cytochrom b5. Geny pro lidské cytochromy b5 byly vloženy do klonovacího vektoru pUC19, amplifikovány v kompetentních buňkách E. coli DH5α a verifikovány DNA sekvenací. Následně byly zkonstruovány a ověřeny expresní vektory pET22b obsahující geny kódující lidský mikrosomální a erytrocytární cytochrom b5. Klíčová slova: Heterologní exprese, genová syntéza, lidský cytochrom b5, izolace

Cytochrome b5 is a small heme protein. There are three isoforms present in human organism, one is located in the membrane of endoplasmic reticulum (microsomal cyt b5), second in the outer mitochondrial membrane and the third (soluble form) was found in cytoplasm of matured erythrocytes. The main role of cytochrome b5 is to transport single electron in various reactions including cytochrome P450-dependent reactions. First aim of the thesis was to prepare and to isolate the soluble form of rabbit microsomal cytochrome b5, using heterologous expression in Escherichia coli strain BL-21 Gold. The plasmid pET22b containing synthetic gene for rabbit microsomal cytochrome b5, lacking the sequence encoding the membrane associated C-terminal domain, was used as an expression vector. The second aim was to synthesize the expression vectors carrying genes for human microsomal and erythrocytic cytochromes b5. These genes were prepared by gene synthesis, ligated to cloning vector pUC19, amplified in E. coli DH5α competent cells and their sequences were verified by DNA sequencing. Consequently the pET22b expression vectors containing genes for human microsomal and erythrocytic cytochrome b5 were constructed and finally their suitability for heterologous expression was evaluated. Keywords: Heterologous expression,...