Studium strukturních rozdílů mezi izoformami 14-3-3 proteinů.

Abstract

Proteiny 14-3-3 jsou regulační proteiny, které se vyskytují v mnoha isoformách ve všech eukaryotických organismech a účastní se řady buněčných dějů. V této práci jsem se zabývala vlivem struktury ohybu H8-H9 u ječmenných isoforem hv 14-3-3A a lidských isoforem 14-3-3ζ na afinitu k vazebnému partnerovi. Z dříve publikovaných výsledků vyplývá, že isoforma hv 14-3-3A se váže s nejmenší afinitou, což může být způsobeno přítomností glycinu v H8-H9 ohybu, na rozdíl od ostatních isoforem, které mají na stejné pozici serin. Vazebnou afinitu jsem zjišťovala jak pro původní protein hv 14-3-3A WT, tak i pro jeho mutant, u kterého byl glycin v H8-H9 ohybu nahrazen serinem. Pro srovnání jsem také provedla měření s lidskou isoformou 14-3-3ζ WT, která v H8-H9 ohybu na studované pozici obsahuje serin, a jejího mutantu, u kterého byl tento serin nahrazen glycinem. Proteiny jsem exprimovala v bakteriích E. coli kmen BL21(DE3) a poté jsem je purifikovala. Disociační konstanty pro vazbu peptidů pRaf značenými sondami FITC a ATTO jsem získala pomocí metod fluorescenční korelační spektroskopie a stacionárního měření intenzity fluorescence. Z naměřených hodnot vyplývá, že v případě lidských i ječmenných isoforem došlo po mutaci ke zhoršení afinty k vazebnému partnerovi.

The 14-3-3 proteins are a family of important regulatory proteins, found in all eukaryotes, which are involved in many cellular processes. In this diploma thesis, we studied structure/function relationships of 14-3-3 proteins, in this case it was the influence of the structure of H8-H9 loop on the binding affinity in barley isoform hv 14-3-3A and human isoform 14-3-3ζ. According to former results, hv 14-3-3A binds to a ligand with lowest affinity, which could be caused by present of a glycin in H8-H9 loop, while in other isoforms there is a serin on the same position. We measured the binding affinity in protein hv 14-3-3A WT and its mutant, which contained the serin instead of the glycin in H8-H9 loop. For comparison, we also measured the binding affinity of human isoform 14-3-3ζ containing the serin in H8-H9 loop and its mutant, where the the serin was replaced by the glycin. Proteins were expressed in E. coli cells strain BL21(DE3) and then purified. The dissociation constant for the binding of peptide pRaf-259 labeled with fluorophores FITC and ATTO was measured using both the fluorescence correlated spectroscopy and the steady-state fluorescence intensity. Our results showed that in both isoforms the mutation of H8-H9 loop causes decrease in the binding affinity.