Využití chemoenzymových metod pro preparativní separaci diastereoisomerů silybinu

Abstract

Flavonolignan silybin je majoritní složkou tzv. silymarinu, což je směs polyfenolických látek izolovaná ze semen ostropestřce mariánského (Silybum marianum). Silybin se využívá především jako hepatoprotektivum, ovlivňuje vylučování toxických látek z organismu a má také antioxidační účinky. V nedávné době bylo zjištěno, že silybin má také významné chemoprotektivní a kancerostatické účinky. Přírodní silybin je směs dvou diastereoisomerů, které jsou preparativně nedělitelné a doposud je lze separovat pouze pomocí preparativní HPLC. V rámci této diplomové práce byla nalezena metoda chirální separace diastereoisomerů silybinu. Byl při ní používán Novozym 435 (lipasa CAL B imobilizovaná na polyakrylamidové pryskyřici), který při použití dvou různých systémů rozpouštědel (toluen/n- butanol nebo TBME/n-butanol) poskytuje jednotlivé silybiny. Optimalizovanou metodou bylo možno připravit 6,3 g silybinu A (d.e. > 95 %) ve výtěžku 42 % a 10,0 g silybinu B (d.e. 95 %) ve výtěžku 67 %. Kromě modifikace reakčních podmínek byl testován i vliv chemických (kovalentních) modifikací samotného enzymu na jeho diastereoselektivitu či aktivitu. Byl připraven acetylovaný, sukcinylovaný a hydroxyethylamidovaný Novozym 435. Zmíněné modifikace ale požadované změny nepřinesly, enzym byl jimi spíše inhibován, pouze acetylovaný...

Silybin is major component of silymarin isolated from seeds of the milk thistle (Silybum marianum). This compound is widely used in human medicine against liver disorders and as a protectant against a number of hepatotoxins. It also exhibits other interesting activities as anticancer and chemoprotective, dermatoprotective and also hypocholesterolemic effects. Natural silybin is a nearly equimolar mixture of two diastereoisomers, silybin A and silybin B, whose analytical separation is quite feasible, but preparative separation is extremely complicated. The aim of this work was to find suitable method leading to separation of both silybin diastereoisomers. A library of hydrolases (lipases, esterases and proteases) was tested for their diastereoisomeric discrimination of the selective alcoholysis of 23-O-acetylsilybins. Novozym 435 (lipase B from Candida antarctica immobilized on acrylic resin) proved to be the most suitable enzyme for the preparative production of both optically pure silybin A and B by enzymatic hydrolysis. Under the optimized conditions, silybin A was obtained in 42 % yield and 97 % purity while silybin B was obtained in 67 % yield and 99 % purity. Covalent modifications of Novozym 435 (acetylation, succinylation, and hydroxyethylamidation), which should lead to improvement of...