Hyaluronan in chondrogenesis of mesenchymal stem cells

Abstract

6 SUMMARY OF THE THESIS The main aim of the project was to develop a methodological approach of in-vitro chondrogenic graft preparation. This graft should utilise mesenchymal stem cells (MSC) seeded in a hyaluronan based scaffold. A review of known hyaluronan derivatives with a potential for biological applications was prepared in the first phase of the project. (Sedova, Knotkova et al. 2007) As a result of the review, a hydrogel based on tyramine derivative of hyaluronan cross-linked by peroxidase (HA-TA scaffold) was chosen for the following research. A sufficiently rich, reliable and ethically acceptable source of MSCs was required. Washed bone marrow collection sets remaining after bone marrow collection for transplantation purposes was demonstrated to meet these needs. (Dvorakova, Hruba et al. 2008) MSCs reveal specific features, namely low seeding density and morphological changes during culture, which may affect the outcome of cell viability measurements in experiments. In order to solve this complication, three different methods of cell viability determination were compared, and the luminiscent detection of intracellular ATP was recommended for MSC applications. (Vistejnova, Dvorakova et al. 2009) Hyaluronan influence on chondrogenic differentiation of MSCs was evaluated in a pellet micromass system...

5 SOUHRN PRÁCE Hlavním cíleM práce bylo vyvinout metodiku přípravy chondrogenního štepu pro možné využití v léčbě poškozené kloubní chrupavky. Tento štěp by měl být založen na kombinaci oporného materiálu (skefoldu) na bázi hyaluronanu s mezenchymálními kmenovými buňkami (MSC). V prvním fázi projektu byl vytvořen přehled známých derivátů hyaluronanu s potenciálním využitím v medicíně. (Sedova, Knotkova et al. 2007) Na základě tohoto přehledu byl pro další využití vybrán hydrogel připravovaný síťováním tyraminového derivátu hyaluronanu působením peroxidázy (HA-TA skefold). Pro experimenty s MSC bylo třeba optimalizovat dostatečně bohatý, spolehlivý a eticky přijatelný zdroj buněčného materiálu. Tento zdroj byl nalezen a ověřen v podobě výplachů odběrových setů používaných pro odběry kostní dřeně při transplantacích. (Dvorakova, Hruba et al. 2008) V rámci projektu bylo nutné stanovovat viabilitu MSC. Na základě porovnání tří různých metod, byla vybrána jako nejvhodnější luminiscenční metoda založená na stanovení intracelulárního ATP, která respektuje specifity MSC - především morfologické změny v průběhu kultivace a nízké nasazovací hustoty. (Vistejnova, Dvorakova et al. 2009) V dalším kroku byl sledován vliv nativního rozpustného hyaluronanu na průběh chondrogenní diferenciace MSC v modelovém peletovém...