Z-scan Fluorescence Correlation Spectroscopy Applied in Studies of Model Phospholipid Membranes

Abstract

(in Czech) Tato práce je věnována lipidovým dvojvrstvám, které do značné míry určují fyzikální vlastnosti biologických membrán. Jedním z klíčových parametrů je mobilita jednotlivých složek v membráně, která je odpovědná za řadu procesů probíhajících v buňce (vazba povrchových proteinů, aktivita povrchových enzymů, agregace peptidů, buněčná adheze). Protože buněčné membrány jsou komplexní a velmi heterogenní systémy, studium jejich biofyzikálních vlastností je značně obtížné. Právě proto jsem ve své práci využívala modelové membránové systémy se zjednodušeným lipidovým složením. Cíle mé práce jsou zaměřeny na následující základní otázky, vztahující se k fosfolipidovým dvojvrstvám připraveným na pevném povrchu (ang, supported phospholipid bilayrs SPBs): Jaký vliv má pevný povrch na laterální difúzi fluorescenčně značených lipidových analogů v membráně? Jaké je propojení mezi jednotlivými vrstvami v SPBs? (publikace I) Jakým způsobem je možné určit přechod fluorescenčních sond a fluorescenčně značených lipidových analogů mezi jednotlivými vrstvami v rámci SPBs ? (publikace II) Jak je laterální difúze fluorescenčně značeného koagulačního proteinu prothrombinu, který je jen slabě vázán k SPBs, propojena s laterální difúzí fluorescenčně značených lipidových analogů v membráně? (publikace III) V této...

6. Summary First of all, the issue whether and to what extent lipid mobility in the bilayer is altered when the bilayer is being deposited on the solid support was addressed. We designed a method that allows a direct comparison of the diffusion coefficients of labelled-lipids in the free-standing lipid bilayer of GUVs and that of the bilayer interacting with the mica surface (SPBs) in the glucose solution. The lateral diffusion analysis strongly indicate that the observed phenomenon is an unrestricted 2D diffusion. The results clearly show that the diffusion is slowed by more than 2 times for the interaction with the support. Moreover, we believe that the quantitative comparison of lipid diffusion in two frequently used model membranes can be helpful when comparing data reported in the literature. Additionally, the obtained data clearly indicate the existence of an inter-leaflet coupling. The lateral diffusion of investigated membrane probes and phospholipid analogues depend on the character and structure of the used fluorescent probe. The obtained lateral diffusion of the flavone probe, F2N12S is significantly faster than that of the fluorescent lipid analogues under study. Moreover, flavone probe exhibits approximately an order of magnitude faster flip-flop in comparison to the Atto633-DOPE lipid analogue...