Characterization of translation machinery in the male gametophyte of Arabidopsis thaliana

Abstract

Samčí gametofyt Arabidopsis thaliana je významným modelem pro studium translace a její regulace. Během svého vývoje procházejí mikrospory výraznou změnou translační aktivity, kdy dozrávají v metabolicky utlumená pylová zrna a po vyklíčení rychle obnovují syntézu bílkovin ze skladovaných mRNA. Tato práce se zabývá tím, jak je translační regulace utvářena v průběhu vývoje pylu, a to s využitím jak metod reverzní genetiky pro charakterizaci esenciálního komplexu eukaryotického translačního iniciačního faktoru 3 (eIF3), tak metod separace a izolace inaktivovaného a aktivního translačního aparátu v pylu a také zavedením nové metody vizualizace translace in vivo. Charakterizace největší podjednotky komplexu eIF3 u Arabidopsis thaliana, AteIF3A, poodhalila její esenciální roli v samčím gametofytu, i když u mutantní T-DNA linie v tomto lokusu byla odhalena chromozomální translokace, jejíž důsledky napodobují reprodukční defekty očekávané u ztrátové mutace ateif3a. Tato linie ukázala, že translokace představují běžně se vyskytující a snadno chybně interpretovatelný typ sekundárních mutací spojených s T-DNA inzercí, a vedla k formulaci validačního rámce pro výzkum rozmnožování rostlin. Separace translačního aparátu v kombinaci s omickými metodami ukázala, že na rozdíl od dominujícího monozomového profilu...

The male gametophyte of Arabidopsis thaliana is an important model for studying translation and its regulation. During its development, microspores undergo a pronounced shift in translational activity, maturing into metabolically quiescent pollen grains and, upon germination, rapidly resuming protein synthesis from stored mRNA. This thesis examines how translational regulation is established across pollen development, using reverse genetic methods to characterize the essential eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) complex, methods for the separation and isolation of the inactivated and active translation machinery in pollen, and the introduction of a novel in vivo translation visualization method. Characterization of the largest eIF3 subunit in Arabidopsis thaliana, AteIF3A, partially revealed its essential role in the male gametophyte, although a T-DNA line mutant in this locus was found to carry a chromosomal translocation whose consequences resemble the reproduction defects expected of a loss-of-function ateif3a mutant. This line demonstrated that translocations are a commonly occurring and easily misinterpreted class of T-DNA-associated secondary mutations and motivated the formulation of a validation framework for plant reproduction research. Separation of the translation machinery...