Využití činidel vázajících aspartát a glutamát pro experimenty kvantitativního chemického zesítění ve spojení s hmotnostní spektrometrií

Abstract

Kvantitativní chemické zesítění je metoda strukturní biologie využívající kovalentní chemické modifikace postranních řetězců aminokyselin v proteinech pro studium jejich struktury a dynamiky. Ve spojení s hmotnostní spektrometrií se jedná o cenný nástroj studia dynamiky proteinů a proteinových komplexů přímo v roztoku či buňce. Ačkoli nejpoužívanější síťovací činidla - NHS estery - modifikují především aminokyselinu lysin, vývoj nových činidel a postupů umožňuje této metodě modifikovat i jiné postranní řetězce a tím zvýšit množství strukturních informací, které je možno pomocí XL-MS získat. Jedním z těchto nových přístupů je využití činidel 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid hydrochloridu (EDC) a dihydrazidu kyseliny adipové (ADH) pro modifikaci a propojení kyselých aminokyselin (kys. asparagová a glutamová). Zmíněný postup byl navržen a na ubikvitinu demonstrován v práci Petra Nováka et. Al [1]. Tato bakalářská práce z této publikace v mnohém čerpá a aplikuje její metodiku na ubikvitin, holomyoglobin a hovězí sérový albumin s využitím izotopově značených činidel. Předmětem a cíli práce je optimalizace reakčních podmínek síťovací reakce a vyhodnocení experimentů kvantitativního chemického zesítění za použití optimalizovaných podmínek. Z použitých modelových proteinů bylo pouze u...

Quantitative chemical crosslinking is a method of structural biology utilizing covalent chemical modification of side chains of the amino acids in proteins to study their structure and dynamics. Coupled with mass spectrometry, it forms a valuable tool for studying protein dynamics and protein complexes directly in solution or in cell. Although the most used crosslinking reagents are the NHS esters, which modify primarily the lysine amino acid, the development of new technologies, reagents and approaches allows new side chains to be modified, effectively increasing the volume of structural information available from XL-MS analysis. One of such approaches is the utilization of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) and adipic acid dihydrazide (ADH) for acidic amino acids (aspartic and glutamic acids) modification and crosslinking. Said approach was developed and demonstrated on ubiquitin in the work of Petr Novák et. Al [1]. This bachelor thesis draws heavily from the aforementioned publication and applies its methods on ubiquitin, holomyoglobin and bovine serum albumin using isotope-labelled reagents. The subject and goals of this work are optimization of crosslinking reaction and evaluation of the quantitative chemical crosslinking experiments using the optimized...