Functional characterization of novel termite terpene synthases

Abstract

1 Abstrakt Terpenoidy jsou rozsáhlá skupina různorodých přírodních látek, které hrají významnou roli jako sekundární metabolity, zejména v chemické komunikaci a obraně různých organismů. Zatímco biosyntéza terpenoidů je dobře popsána u rostlin a bakterií, hmyzí enzymy zodpovědné za jejich biosyntézu zůstávají nedostatečně prozkoumány. Doposud bylo charakterizováno pouze omezené množství hmyzích terpensynthas (TPS), které na rozdíl od kanonických rostlinných TPS vznikly duplikací a neofunkcionalizací genů pro isoprenyldifosfátsynthasy (IDS). Tyto hmyzí TPS si však zachovaly původní alfahelikální fold a další strukturní motivy typické pro IDS, i když došlo ke změně jejich enzymatické aktivity. Tato práce se zabývá změnami vedoucími k přechodu od IDS aktivity k terpensynthasové aktivitě dvou vybraných enzymů NtGGPPS6 a NtGGPPS7 pocházejících z termitů Nasutitermes takasagoensis. Oba tyto proteiny byly heterologně exprimovány v organismu E. coli, purifikovány a jejich aktivita byla analyzována pomocí instrumentálních metod GC-MS a LC-MS. Bylo pozorováno, že enzym NtGGPPS6 vykazuje seskvi- a diterpensynthasovou aktivitu, zatímco u enzymu NtGGPPS7 zůstala zachována aktivita IDS. Rovněž bylo zjištěno, že mutageneze konzervovaného motivu KT (T152I) způsobila u enzymu NtGGPPS6 ztrátu její diterpencyklasové aktivity...

1 Abstract Terpenoids are a large group of ubiquitous natural compounds with an essential role as secondary metabolites, particularly in chemical communication and defence. While terpenoid biosynthesis is well described in plants, the enzymatic basis in insects remains poorly understood. Only a handful of insect terpene synthases (TPSs) have been characterized so far. Unlike canonical plant TPS, insect TPS enzymes arose independently by duplication and neofunctionalization of isoprenyl diphosphate synthase (IDS) genes, retaining the IDS α-helical fold and several structural motifs while gaining new catalytic activity. To explore the structural changes leading to the shift from IDS to TPS activity, two enzymes from Nasutitermes takasagoensis, NtGGPPS6 and NtGGPPS7 were selected for this thesis. Both proteins were heterologously expressed in E. coli, purified, and assayed by GC-MS and LC-MS to confirm their activity, which showed NtGGPPS6 acting as a sesquiterpene and diterpene synthase, while NtGGPPS7 retained canonical IDS activity. Mutagenesis of the conserved KT motif (T152I) in NtGGPPS6 caused loss of diterpene cyclase activity and shifted nerolidol production toward the (3R,6E) enantiomer, while a second mutation (V25K) had no effect. The crystal structure of NtGGPPS6 was solved at 2.60 Å, revealing a...