Analysis of the mature and zymogenic forms of the SARS-CoV-2 main protease

Abstract

In 2019, the COVID-19 pandemic emerged. Its causative agent, SARS-CoV-2, a betacorona- virus with a positive-sense single-stranded RNA genome, utilizes a polyprotein strategy. One of the proteases responsible for processing viral polyproteins, the SARS-CoV-2 main protease (Mpro , EC 3.4.22.69), is a key target for antiviral drug development. This thesis investigates the release of Mpro from its precursor, examines unique features of the precursor form, and describes the development of systems for evaluating small-molecule Mpro inhibitors. During preparation of a recombinant precursor Mpro model, we observed non-canonical cleav- age specificity. Although glutamine at the P1 position of natural Mpro cleavage sites is strictly conserved, several mutations at this position did not abolish in cis autoprocessing. A slowly processing mutant containing a glutamine-to-alanine substitution was used to design an expres- sion construct that enabled production of Mpro with authentic termini in fewer purification steps. Further investigation of the N-terminal cleavage site revealed that a glutamine-to-isoleucine substitution produced an unprocessed precursor form, facilitating preparation of this recombi- nant protein for subsequent analysis. As a complementary tool, we developed a eukaryotic cell- based assay...

V roce 2019 se objevila pandemie COVID-19. Její původce, betakoronavirus SARS-CoV-2 s genomem tvořeným pozitivní jednovláknovou RNA, využívá polyproteinovou strategii. Jedna z proteas štěpících virové polyproteiny, Mpro (z angl. main protease, hlavní proteasa, EC 3.4.22.69), je důležitým cílem při vývoji protivirových léčiv. Tato práce zkoumá uvolňování Mpro z prekurzoru, studuje unikátní vlastnosti prekurzorové formy a popisuje vývoj systémů pro testování nízkomolekulárních inhibitorů Mpro . Při přípravě rekombinantního prekurzoru Mpro jsme pozorovali nekanonickou proteolytickou aktivitu. Přestože glutamin je v P1 pozici přirozeného štěpného místa Mpro striktně konzervován, vícero mutací v této pozici nebylo schopno zabránit in cis štěpení. Pomalu se štěpící mutant nesoucí záměnu glutaminu za alanin byl použit pro vývoj expresního konstruktu umožňujícího získat Mpro s autentickými konci pomocí redukovaného počtu purifikačních kroků, v porovnání se standardními postupy. Další zkoumání N-koncového štěpného místa odhalilo, že záměnou glutaminu za isoleucin lze dosáhnout stabilizace prekurzorové formy a byla tak umožněna příprava rekombinantního prekurzoru pro další studie. Jako komplementární metodu jsme vyvinuli eukaryotický buněčný systém s fúzním proteinem sestávající z Mpro a dvou fluorescenčních...