Nonlinearity imaging in fluorescence microscopy

Abstract

Excitation saturation is usually avoided in fluorescence microscopy because it makes the fluorescence response nonlinear. In this thesis, we exploit this nonlinearity to improve the spatial resolution of fluorescence imaging beyond the standard diffraction limit. Flu- orescence images recorded at three excitation intensities in the nonlinear part of the saturation curve are separated into individual orders by simple algebraic post-processing. The second-order image provides the best compromise between improved resolution and reduced signal-to-noise ratio. The theoretically achievable PSF narrowing is to a first approximation 1.41 fold in both the lateral and axial direction. We verify the method by nonlinear imaging of 282 nm Nile Red beads, whose image decreases by about 17% laterally and 33% axially, allowing two adjacent beads to be resolved. To demonstrate the general applicability of the method, we also image 100 nm fluorescent beads, chlorosome- inspired bacteriochlorophyll aggregates, and chloroplasts within intact leaves, demon- strating applicability across different sample types, including biologically relevant speci- mens, and across different origins of fluorescence nonlinearity.

Vo fluorescenčnej mikroskopii sa zvyčajne snažíme vyhnúť saturácii excitácie, pre- tože vedie k nelineárnej fluorescenčnej odozve. V tejto práci túto nelinearitu využívame na zlepšenie priestorového rozlíšenia fluorescenčného zobrazovania nad rámec štandard- ného difrakčného limitu. Fluorescenčné snímky zaznamenané pri troch intenzitách exci- tácie v nelineárnej časti saturačnej krivky sa pomocou jednoduchého algebraického post- processingu rozdelia na jednotlivé rády. Obraz druhého rádu poskytuje najlepší kom- promis medzi zlepšeným rozlíšením a zhoršeným pomerom signálu k šumu. Teoreticky dosiahnuteľné zúženie PSF je 1,41-násobné v laterálnom aj axiálnom smere. Metódu ove- rujeme nelineárnym zobrazovaním 282 nm Nile Red guličiek, ktorých obraz sa zmenšuje o približne 17% v laterálnom smere a 33% v axiálnom smere, čo umožňuje rozlíšiť dve susedné guličky. Aby sme demonštrovali všeobecnú použiteľnosť tejto metódy, zobrazili sme aj 100 nm fluorescenčné guličky, agregáty bakteriochlorofylov inšpirované chlorosó- mami a chloroplasty v neporušených listoch, čím sme preukázali použiteľnosť na rôznych typoch vzoriek, vrátane biologicky relevantných vzoriek, a pri rôznych pôvodoch nelinea- rity fluorescencie.