Cílená mutageneze glykosidas a analýza jejich substrátové specifity

Abstract

Enzymatically catalysed transglycosylation represents an effective strategy for the synthesis of complex carbohydrates. Compared to classical methods of organic synthesis, enzymatic catalysis offers higher selectivity, milder reaction conditions, and often fewer reaction steps. Among the enzymes applicable for this purpose are glycosidases, which in vivo catalyse hydrolysis; however, under suitable laboratory conditions, they are also capable of catalysing transglycosylation - the transfer of carbohydrate units leading to the formation of a glycosidic bond. This work focuses on the study of the effects of point mutations, designed by molecular modelling, in the vicinity of the active site of β-N-acetylhexosaminidase from Talaromyces flavus (EC 3.2.1.52, GH20), a retaining exo-glycosidase that naturally catalyses the cleavage of both β-N-acetylglucosamine (GlcNAc) and β-N-acetylgalactosamine (GalNAc). Within this study, mutant variants E546F, W544P, and H300S were prepared, heterologously expressed in Pichia pastoris, purified, and subsequently characterised. The effect of the introduced mutations in the active site vicinity on the enzymatic activity and substrate specifity was investigated. The E546F variant was successfully expressed; however, the amino acid substitution resulted in enzyme...

Enzymově katalyzovaná transglykosylace představuje jednu z účinných strategií pro syntézu komplexních sacharidů. Ve srovnání s klasickými metodami organické syntézy nabízí enzymová syntéza vyšší selektivitu, šetrnější reakční podmínky a často i menší počet reakčních kroků. Mezi využitelné enzymy patří glykosidasy, které in vivo katalyzují hydrolýzu, avšak za vhodných laboratorních podmínek jsou schopny katalyzovat transglykosylace, tedy přenos sacharidových jednotek za vzniku glykosidové vazby. Tato práce se zabývá studiem vlivu bodových mutací navržených pomocí molekulárního modelování v okolí aktivního centra β-N-acetylhexosaminidasy z Talaromyces flavus (EC 3.2.1.52, GH20), což je retenující exo-glykosidasa, která za přirozených podmínek katalyzuje štěpení jak β-N-acetylglukosaminu (GlcNAc), tak i β-N-acetylgalaktosaminu (GalNAc). V rámci práce byly připraveny mutantní varianty E546F, W544P a H300S tohoto enzymu, které byly heterologně exprimovány v Pichia pastoris, purifikovány a následně charakterizovány. Byl studován vliv vnesených mutací v okolí aktivního centra na enzymovou aktivitu a substrátovou specifitu těchto variant. Varianta E546F byla sice úspěšně exprimována, avšak daná aminokyselinová záměna způsobila inaktivaci enzymu. U variant W544P a H300S byl pozorován posun substrátové...