Vliv hemu na strukturu a enzymovou aktivitu pyruvátkinázy M2

Abstract

This diploma thesis deals with the interaction between heme and pyruvate kinase M2, an important glycolytic enzyme involved in the regulation of cellular metabolism. The main aim of this thesis was to characterize the effect of heme on the oligomeric state of pyruvate kinase M2, its kinetic parameters, and its potential modulatory effects in the presence of other known modulators of pyruvate kinase M2. For the study of this interaction, the plasmid pET-21c(+)- N-term.-His-SUMO-TEV-PKM2 was first prepared and successfully used to transform E. coli BL-21(DE3) cells. Protein expression of pyruvate kinase M2 was induced in these cells, and subsequently two highly pure preparations of pyruvate kinase M2 were successfully purified, differing in the presence of glycerol during purification. One of the aims of this thesis was to study the oligomeric state of the pyruvate kinase M2 enzyme under different conditions using dynamic light scattering. It was found that heme did not affect the oligomeric state of pyruvate kinase M2 alone or in the presence of fructose-1,6-bisphosphate. However, in the presence of phenylalanine, an approximately twofold increase in the molecular weight of the pyruvate kinase M2 complex caused by heme was observed. The interaction of heme with pyruvate kinase M2 was also studied...

Tato diplomová práce se zabývá interakcí hemu s pyruvátkinázou M2, významným enzymem glykolýzy, který se podílí na regulaci buněčného metabolismu. Hlavním cílem práce bylo charakterizovat vliv hemu na oligomerní stav pyruvátkinázy M2, její kinetické parametry a potencionální modulační účinky v přítomnosti jiných již známých modulátorů pyruvátkinázy M2. Pro studium této interakce byl nejdříve připraven plazmid pET-21c(+)-N-term.-His- SUMO-TEV-PKM2, kterým byly úspěšně transformovány buňky E. coli BL-21(DE3). U těchto buněk byla indukována exprese proteinu pyruvátkinázy M2 a následně byly úspěšně purifikovány dva vysoce čisté preparáty pyruvátkinázy M2, lišící se přítomností glycerolu během purifikace. Jedním z cílů této práce bylo studium oligomerního stavu enzymu pyruvátkinázy M2 za různých podmínek pomocí dynamického rozptylu světla. Bylo zjištěno, že hem neovlivňuje oligomerní stav pyruvátkinázy M2 samotné ani v přítomnosti fruktóza-1,6- bisfosfátu. V přítomnosti fenylalaninu však bylo pozorováno přibližné zdvojnásobení molekulové hmotnosti komplexu pyruvátkinázy M2 vlivem hemu. Interakce hemu s pyruvátkinázou M2 byla v rámci této práce za stejných podmínek studována také spektrofotometrickou titrací hemem. Bylo zjištěno, že preparáty samotného enzymu pyruvátkinázy M2 i pyruvátkinázy M2 v...