Charakterizace vybraných methyltransferas z patogenních bakterií

Abstract

Methyltransferases represent a large group of enzymes that catalyze the transfer of a methyl group, most commonly from S-adenosyl-L-methionine to various types of substrates, including DNA, RNA, proteins, and small molecules. In pathogenic bacteria, they are involved in the regulation of gene expression, translational accuracy, modification of the cell envelope, metabolic adaptation, and virulence [1]. Since these enzymes are involved in several crucial biological processes, methyltransferases represent an interesting group of potential antibacterial targets. In Mycobacterium tuberculosis, the search for new therapeutic targets is particularly important due to the long duration of tuberculosis treatment, the toxicity of current drugs, and the emergence of resistant strains [2]. This diploma thesis focuses on the preparation of selected methyltransferases from M. tuberculosis and their subsequent use in binding and biochemical studies aimed at identifying potential inhibitors. The selected proteins were recombinantly produced in an Escherichia coli expression system and purified using chromatographic methods. Ligand binding was analyzed by fluorescence polarization assays using fluorescently labeled SAH analogues. The established binding assays were subsequently used for competitive screening of a...

Methyltransferasy představují rozsáhlou skupinu enzymů katalyzujících přenos methylové skupiny, nejčastěji z S-adenosyl-L-methioninu, na různé typy substrátů včetně DNA, RNA, proteinů a malých molekul. u patogenních bakterií se podílejí na regulaci genové exprese, přesnosti translace, modifikaci buněčného obalu, metabolické adaptaci a virulenci [1]. Díky své účasti v těchto biologicky významných procesech představují methyltransferasy zajímavou skupinu potenciálních antibakteriálních cílů. u Mycobacterium tuberculosis je hledání nových terapeutických cílů zvláště důležité vzhledem k dlouhé době léčby tuberkulózy, toxicitě současných léčiv a vzniku rezistentních kmenů [2]. Tato diplomová práce se zabývá přípravou vybraných methyltransferas z M. tuberculosis a jejich následným využitím pro vazebné a biochemické studie zaměřené na identifikaci potenciálních inhibitorů. Vybrané proteiny byly rekombinantně připraveny v expresním systému Escherichia coli a purifikovány chromatografickými metodami. Pro analýzu vazby ligandů byly provedeny testy fluorescenční polarizace s využitím fluorescenčně značených analogů SAH. Zavedené vazebné testy byly následně využity ke kompetičnímu screeningu knihovny analogů SAH. Ligandy s nejvyšší zdánlivou afinitou byly vybrány pro krystalizační experimenty jako potenciální...