Characterization of Selected Methyltransferases from Pathogenic Bacteria

Abstract

Antimicrobial resistance represents a major global health threat, and methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) remains one of the most clinically important resistant pathogens. Ribosomal RNA methyltransferases are involved in ribosome maturation and maintenance of translation fidelity through post-transcriptional modification of rRNA. Ribosomal methylation is also associated with antibiotic resistance, as it can alter antibiotic binding sites within the ribosome and reduce the effectiveness of ribosome-targeting antibiotics. In addition, several ribosomal methyltransferases contribute to bacterial virulence and adaptation to adverse conditions such as oxidative stress. Due to their biological importance, these enzymes represent promising targets for structural characterization and future inhibitor development. This thesis focused on three selected ribosomal methyltransferases from S. aureus: RsmA, RsmH, and RsmI. Recombinant plasmids encoding the target proteins were prepared, followed by recombinant expression in E. coli, protein purification, and crystallization screening in complex with selected ligands. RsmH was successfully purified to high purity and yielded crystals suitable for X-ray diffraction analysis. In contrast, RsmA could not be obtained in sufficient purity for structural...

Antimikrobiální rezistence představuje závažnou globální zdravotní hrozbu a methicilin- rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA) patří mezi klinicky nejvýznamnější rezistentní patogeny. Ribozomální RNA methyltransferázy se podílejí na maturaci ribozomu a udržování přesnosti translace prostřednictvím posttranskripčních modifikací rRNA. Ribozomální methylace je zároveň spojena s antibiotickou rezistencí, protože může měnit vazebná místa antibiotik v ribozomu a snižovat účinnost antibiotik cílených na ribozom. Některé ribozomální methyltransferázy se navíc podílejí na virulenci bakterií a adaptaci na nepříznivé podmínky, například oxidativní stres. Vzhledem ke svému biologickému významu představují tyto enzymy perspektivní cíle pro strukturní charakterizaci a budoucí vývoj inhibitorů. Tato diplomová práce se zaměřila na tři vybrané ribozomální methyltransferázy ze S. aureus: RsmA, RsmH a RsmI. Byly připraveny rekombinantní plazmidy kódující cílové proteiny, následovala jejich rekombinantní exprese v E. coli, purifikace proteinů a krystalizační screening v komplexu s vybranými ligandy. Protein RsmH byl úspěšně purifikován ve vysoké čistotě a poskytl krystaly vhodné pro rentgenovou difrakční analýzu. Naproti tomu protein RsmA nebylo možné získat v dostatečné čistotě pro strukturní studie, zatímco RsmI...