Vývoj fluorescenčních senzorů pro proteasu latentního sférického viru jabloně (ALSV)

Abstract

4 Abstract Apple Lytic Spherical Virus (ALSV) is a plant RNA virus of the genus Cheravirus that causes asymptomatic infections in apple trees. Due to its ability to infect a wide range of host species and the latent nature of the infection, ALSV can be used in biotechnological applications such as virus-induced gene silencing and flowering. The ALSV protease (ALSVp) processes viral polyproteins probably at seven known cleavage sites, but it has not yet been characterized in detail. It is unknown whether it cleaves all seven sites equally or what the optimal conditions for its activity are. The aim of this work was to develop fluorescent sensors for the detection and characterization of ALSVp activity. Two types of reporters were prepared and tested. Constructs utilizing the folding of the beta-sheet of a fluorescent protein (Flip) and sensors based on Förster resonance energy transfer (FRET). The FlipGFP and FlipCherry constructs proved unsuitable for use in plants. FlipGFP spontaneously refolded even in the absence of protease, while FlipCherry did not exhibit a detectable signal after cleavage. During the development of FRET sensors, five combinations of donor-acceptor pairs were tested in Escherichia coli. The combination of TagBFP (donor) and mVenus (acceptor) was selected as optimal. The donor and...

Latentní sférický virus jabloně (ALSV) je rostlinný RNA virus rodu Cheravirus, který u jabloní vyvolává bezpříznakové infekce. Díky schopnosti infikovat široké spektrum hostitelských druhů a latentním projevům infekce nalézá ALSV uplatnění v biotechnologiích, jako je virem indukované umlčení genů a kvetení. ALSV proteasa (ALSVp) zpracovává virové polyproteiny pravděpodobně v sedmi známých štěpných místech, avšak dosud nebyla podrobněji charakterizována. Není známo, zda katalyticky působí na všech sedm míst stejně ani jaké jsou optimální podmínky její aktivity. Cílem této práce byl vývoj fluorescenčních senzorů pro detekci a charakterizaci aktivity ALSVp. Byly připraveny a testovány dva typy reportérů. Konstrukty využívající restrukturalizace beta-skládaného listu fluorescenčního proteinu (Flip) a senzory založené na principu Försterova rezonančního přenosu energie (FRET). Konstrukty FlipGFP a FlipCherry se pro použití v rostlinách ukázaly jako nevhodné. U FlipGFP docházelo k samovolnému složení i v nepřítomnosti proteasy, zatímco FlipCherry nevykazoval po štěpení detekovatelný signál. Při vývoji FRET senzorů bylo v Escherichia coli otestováno pět kombinací donor-akceptorových párů. Jako optimální byla vybrána kombinace TagBFP (donor) a mVenus (akceptor). Donor a akceptor byly spojeny peptidovým...