Příprava oligosacharidů mateřského mléka enzymovými metodami

Abstract

Human milk oligosaccharides have fundamental importance for the development of the infant microbiome and immunity. However, their enzymatic synthesis using in vitro biocatalysis is limited by the side hydrolytic activity of native glycosidases. This thesis deals with the optimization of the heterologous production of β3-N-acetylhexosaminidase from Bifidobacterium bifidum (BbhI), a highly regioselective enzyme cleaving and forming β- (1→3)-glycosidic bonds. Within this thesis, the production of the WT enzyme under cold conditions and its purification were successfully optimized, including the preparation of the expression construct bbhI-link by inserting a structural linker sequence. An analytical glycosylation screening with lactose derivatives and fluorinated methyl lactosides was performed. To suppress the natural hydrolysis, four mutant variants of the BbhI-link enzyme (Y827F, Y827N, D746G, D746N) were prepared by site-directed mutagenesis. A basic biochemical and kinetic characterization of these variants was performed, which, along with the screening of analytical transglycosylation reactions with Lac-O-EtN₃, confirmed a significant suppression of hydrolytic activity in all mutant variants and revealed the influence of the introduced individual mutations on substrate affinity. The mutant...

Oligosacharidy mateřského mléka mají zásadní význam pro rozvoj kojeneckého mikrobiomu a imunity. Jejich enzymová syntéza pomocí in vitro biokatalýzy je však limitována vedlejší hydrolytickou aktivitou nativních glykosidas. Tato diplomová práce se zabývá optimalizací heterologní produkce β3-N-acetylhexosaminidasy z Bifidobacterium bifidum (BbhI), vysoce regioselektivního enzymu štěpícího a tvořícího β-(1→3)-glykosidové vazby. V rámci práce byla úspěšně optimalizována produkce WT enzymu za chladových podmínek a jeho purifikace, jíž předcházela příprava expresního konstruktu bbhI-link vložením sekvence strukturního můstku. Byl proveden analytický screening glykosylace s deriváty laktosy a fluorovanými methyllaktosidy. Pro potlačení přirozené hydrolýzy byly připraveny cílenou mutagenezí čtyři mutantní varianty enzymu BbhI-link (Y827F, Y827N, D746G, D746N). Byla provedena základní biochemická a kinetická charakterizace těchto variant, které spolu se screeningem analytických transglykosylačních reakcích s Lac-O-EtN3 potvrdily výrazné potlačení hydrolytické aktivity u všech mutantních variant a odhalily vliv vnesených jednotlivých mutací na afinitu k substrátu. Jako nejlepší biokatalyzátor se ukázala mutantní varianta BbhI-link Y827F, která v přítomnosti 30% acetonitrilu vykazovala nejvyšší poměr...