HPLC analýza amanitinů obsažených v Amanita phalloides

Abstract

(EN) This bachelor's thesis was focused on the development of a RP-HPLC method with diode array detection and tandem mass spectrometry for the determination of α-amanitin and β- amanitin in heat-treated Amanita phalloides caps. During the optimalization of MS/MS detection, MRM transitions were identified for α-amanitin (919 → 259), -amanitin (920 → 259) and internal standard colchicine (400 → 295). Separation was performed on an XSelect® CSH™ Phenyl-hexyl (4.6×100 mm, 2.5 μm) column with mobile phase composition of 1mmol l−1 ammonium acetate at pH 3.3 and methanol in a 45:55 (v/v) ratio. Under optimal conditions, calibration curves were measured in the range from 0.1 μg ml−1 to 10 μg ml−1 for DAD detection, for tandem mass detection, the measured range was from 0.1 μg ml−1 to 15 μg ml−1 . Toxins were extracted from dried Amanita phalloides caps that were both untreated (control sample) and heat-treated. A mixture of methanol and 0.1% aqueous formic acid solution in a 1:1 ratio was selected for the extraction. After the addition of the internal standard colchicine, the extracts were analyzed using an optimized HPLC-DAD-MS/MS method. The concentration of both amanitins in the heat-treated caps decreased compared to the control sample. Key words: Amanita phalloides, death cap, α-amanitin, -amanitin,...

(CZ) Tato bakalářská práce byla zaměřena na vývoj RP-HPLC metody s detekcí diodovým polem a spektrometrickou tandemovou hmotnostní detekcí pro stanovení α-amanitinu a -amanitinu v tepelně upravených kloboucích Amanita phalloides. Při optimalizaci MS/MS detekce byly nalezeny MRM přechody α-amanitinu (919 → 259), -amanitinu (920 → 259) a interního standardu kolchicinu (400 → 295). Separace byla prováděna na koloně XSelect® CSH™ Phenyl-hexyl (4,6×100 mm, 2,5 μm) o složení mobilní fáze: 1mmol l− octan amonný o pH 3,3 a methanol v poměru 45:55 (v/v). Za optimálních podmínek byly proměřeny kalibrační závislosti v rozmezí od 0,1 μg ml−1 do 10 μg ml−1 pro DAD detekci, pro tandemovou hmotnostní detekci bylo proměřované rozmezí od 0,1 μg ml−1 do 15 μg ml−1. Byla provedena extrakce toxinů ze sušeného klobouku Amanita phalloides tepelně neupraveného (kontrolní vzorek) i teplotně upraveného Pro extrakci byla zvolena směs methanolu a vodného roztoku 0,1% mravenčí kyseliny v poměru 1:1. Extrakty byly po přídavku IS kolchicinu proměřeny optimalizovanou HPLC-DAD-MS/MS metodou. Koncentrace amanitinů v tepelně upravených kloboucích se snížila oproti kontrolnímu vzorku. Klíčová slova: Amanita phalloides, muchomůrka zelená, α-amanitin, -amanitin, HPLC- DAD-MS/MS