Investigation of new possibilities for regulation of temperature-sensitive TRP channels

Abstract

The transient receptor potential vanilloid 2 (TRPV2) channel is a widely expressed thermo- and mechano-sensitive, non-selective cation channel implicated in diverse physiological processes, including axon outgrowth and phagocytosis. Its functional characterization has been limited due to the lack of specific agonists and pronounced species- dependent differences in channel activation properties. Using comparative sequence analysis, site-directed mutagenesis, patch-clamp electrophysiology, and molecular dynamics simulations, we define the molecular basis of divergent TRPV2 activation properties across species, with an emphasis on the human ortholog. We identified the TRPV2 channel sensitive to tannic acid and auto-oxidized form of epigallocatechin gallate. We proposed a novel activation protocol, able to activate rodent as well as human TRPV2 orthologs. We demonstrate that the resistance of human TRPV2 channel to stimuli is not due to a single residue in the ligand binding sites but most likely an allosteric mechanism that includes distinct parts of the channel. Lastly, we identified two main regions near the inner leaflet of the plasma membrane, and the pore turret to be important in the channel activation and stabilizing the channel's closed and open states. These results provide a structural...

Transientní receptorový potenciálový vanilloidní kanál 2 (TRPV2) představuje široce exprimovaný, termo- a mechanosenzitivní neselektivní kationtový kanál, který se uplatňuje v celé řadě fyziologických procesů, včetně růstu axonů a fagocytózy. Jeho funkční charakterizace je však dosud limitována nedostatkem specifických agonistů a výraznými mezidruhovými odlišnostmi v aktivačních vlastnostech. Tato práce se zaměřuje na objasnění molekulární podstaty těchto rozdílů prostřednictvím komparativní analýzy sekvencí, cílené mutageneze, patch-clamp elektrofyziologie a simulací molekulární dynamiky, se zvláštním důrazem na lidský ortolog. Experimentální měření prokázala, že je TRPV2 citlivý na kyselinu tříslovou a auto-oxidovanou formu epigalokatechin galátu. Zároveň jsme navrhli dosud nepopsaný aktivační protokol schopný aktivovat nejen hlodavčí, ale i lidský ortolog. Prokázali jsme, že odolnost lidského TRPV2 vůči podnětům není způsobena jednotlivými residui ve vazebných místech pro ligandy, ale alosterickým mechanismem zahrnujícím strukturálně odlišné části kanálu. V neposlední řadě, jsme identifikovali dvě hlavní místa v blízkosti cytoplazmatické strany membrány a pórový výběžek jako klíčové oblasti pro aktivaci kanálu a stabilizaci jeho uzavřeného i otevřeného stavu. Získané výsledky poskytují...