The role of senescence in the pathology of dysmorphic neurons in focal cortical dysplasia type II

Abstract

Focal cortical dysplasia II (FCDII) is a common cause of pediatric drug-resistant epilepsy that is characterized by the presence of dysmorphic neurons responsible for generating epileptic seizures. These cells harbor somatic mutations in the mTOR signalling pathway, leading to its hyperactivation, and simultaneously display several features of co-called senescent cells. In this work, we created an in vitro model of neuron-like cells with an inducible mutation impairing mTOR signalling pathway and monitored its effect on the induction of a senescent phenotype in these cells. A DNA plasmid carrying a doxycycline-inducible RHEB sequence with the c.110C>T mutation causing mTOR hyperactivation was generated by Gibson assembly cloning method. The prepared construct was transfected into neuroblastoma SH-SY5Y cell line further differentiated into neuron-like cells. Neuronal identity was confirmed based on morphological characteristics and β3-tubulin expression. The expression of RHEB mutated variant was subsequently validated by observing increase in phosphorylation of S6 kinase, a downstream effector of mTORC1. After long-term hyperactivation of mTOR signalling, several senescence- associated features were observed in our model, namely enlarged cellular body, axon reduction and loss of neurite integrity,...

Fokální kortikální dysplázie typu II (FCDII) se řadí mezi nejčastější příčiny farmakorezistní epilepsie u dětských pacientů. Je charakterizována přítomností dysmorfních neuronů, které zapřičiňují vznik epileptických záchvatů. Tyto buňky obsahují somatické mutace v mTOR signální dráze, které vedou k její hyperaktivaci, a zároveň vykazují znaky tzv. senescentních buněk. V této práci jsme vytvořili in vitro model buněk podobných neuronům s indukovatelnou mutací poškozující signální dráhu mTOR a sledovali jsme její vliv na indukci senescentního fenotypu v těchto buňkách. DNA plazmid nesoucí doxycyklinem indukovatelnou sekvenci RHEB s mutací c.110C>T způsobující hyperaktivaci mTOR byl vytvořen metodou klonování Gibson assembly. Připravený konstrukt byl transfekován do neuroblastomové buněčné linie SH-SY5Y, která byla dále diferencována do neuronům podobných buněk. Neuronální identita buněk byla potvrzena na základě morfologických charakteristik a exprese β3-tubulinu. Exprese mutované varianty RHEB byla následně validována pozorováním zvýšené fosforylace S6 kinázy, která je přímým cílem komplexu mTORC1. Po dlouhodobé hyperaktivaci signalizace mTOR bylo v našem modelu pozorováno několik znaků typických pro senescenci, konkrétně zvětšení těla buněk, redukce axonů, ztráta integrity neuritů a zvýšená...