Rekombinatní příprava N-glykanázy z půdní bakterie Dyella japonica

Abstract

PNGases are enzymes cleaving N-glycosidic bonds in glycoproteins, a property utilized in structural biology methods, such as hydrogen-deuterium exchange mass spectometry (HDX/MS). The aim of this bachelor thesis was the recombinant production of a recently discovered PNGase from bacteria Dyella japonica (PNGase Dj) and its subsequent immobilization onto a solid resin. By transforming E. coli cells with a plasmid carrying the respective gene, followed by protein expression and affinity chromatography purificatin, a pure solution of the target enyzme exhibiting high hydrolytic activity was obtained. Finally, the prepared deglycosylation column demonstrated the capability to release N-glycans from glycoproteins, albeit with limited on-line efficiency. Future research should therefore focus on the optimization of the immobilization process to improve the performance of the deglycosylation column for practical analytical applications. [IN CZECH] Key words: Proteins, post-translational modifications, N-glycosylation, mass spectrometry, recombinant proteins, protein purification

PNGázy jsou enzymy štěpící N-glykosidické vazby glykoproteinů, čehož se využívá v metodách strukturní biologie, jako je vodík-deuteriová výměna spojena s hmotnostní spektrometrií (HDX/MS). Cílem této bakalářské práce byla rekombinantní produkce jedné nedávno objevené PNGázy z bakterie Dyella japonica (PNGáza Dj) a její následná imobilizace na pevný nosič. Transformací buněk E. coli plazmidem nesoucím příslušný gen, po níž následovala produkce a purifikace afinitní chromatografií, byl získán čistý roztok cílového proteinu s vysokou hydrolytickou aktivitou. Nakonec byla u připravené deglykosylační kolony prokázána schopnost imobilizovaného enzymu uvolnit N-glykany z glykoproteinů s limitovanou účinností. Další výzkum by se proto mohl zabývat optimalizací imobilizačního kroku pro dosažení lepších vlastností deglykosylační kolony pro praktické analytické využití. Klíčová slova: Proteins, post-translational modifications, N-glycosylation, mass spectrometry, recombinant proteins, protein purification