Syntetické substráty proteas rostlinných virů

Abstract

Viral proteases play a key role in regulating the viral life cycle through the proteolytic processing of viral polyproteins, but they are also utilized in biotechnology. In this study, we investigated fluorescent substrates based on the principle of Förster resonance energy transfer (FRET). The protease of the tobacco etch virus (TEVpr) and the little-known protease of the apple latent spherical virus (ALSVpr) were studied. First, proteolytic activity was determined using a pair of fluorescent proteins (mEGFP, mCherry, LSSmOrange, TagBFP, mVenus) as donor and acceptor, linked by a flexible peptide containing the cleavage site sequence. In the case of the TEV protease, this was the ENLYFQS sequence, while for the ALSV protease and the TagBFP-mVenus pair, the sequences of all 7 sites that it can potentially cleave in viral polyproteins were used. An advantage of these FRET substrates is the ability to monitor both the substrate and the product of the protease-catalyzed reaction in a gel following SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Additionally, by lowering the denaturation temperature to 70 řC, the fluorescence itself can be monitored using a transilluminator, with the results agreeing with immunochemical detection. Furthermore, the substrate Dabcyl-ENLYFQGSPE-Edans was used for the fluorimetric...

Virové proteasy mají proteolytickým zpracováním virového polyproteinu klíčovou úlohu v regulaci životního cyklu virů, ale také jsou využívány biotechnologicky. V této práci byly studovány peptidomimetické fluorescenční substráty využívající principu Försterova rezonančního přenosu energie (FRET). Studována byla proteasa viru leptané mozaiky (TEVpr) a málo známá proteasa latentního sférického viru jabloně (ALSVpr). Nejprve bylo využito stanovení proteolytické aktivity využívající dvojici fluorescenčních proteinů (mEGFP, mCherry, LSSmOrange, TagBFP, mVenus) jako donoru a akceptoru navzájem spojených flexibilním peptidem obsahující sekvenci štěpného místa. V případě TEV proteasy se jednalo o sekvenci ENLYFQS, zatímco pro ALSV proteasu a dvojici TagBFP a mVenus byly využity sekvence všech 7 míst, které potenciálně může ve virových polyproteinech štěpit. Výhodou těchto FRET substrátů je možnost sledovat jak substrát, tak produkt reakce katalyzované proteasou v gelu po SDS-elektroforéze. Zároveň při snížení denaturační teploty na 70 řC je možné sledovat i samotnou fluorescenci pomocí transiluminátoru, přičemž výsledky se shodují s imunochemickou detekcí. Dále byl pro fluorimetrické stanovení aktivity TEV proteasy využit substrát Dabcyl-ENLYFQGSPE-Edans, pomocí kterého bylo optimalizováno složení reakční...