In situ tagging of GET pathway protein in Giardia intestinalis

Abstract

Giardia intestinalis is a tetraploid protozoan which parasitizes the human intestine. A homologue of Bag6 was recently identified in G. intestinalis and proposed to be an ortholog to the Bag6 protein, which was thought to be uniquely metazoan. Finding such a protein suggests the ancient nature of Bag6, perhaps dating back to LECA. In this thesis GiBag6 was modified with a BAP-tag on its N - terminus, using CRISPR-Cas9 system to ensure native expression. It was then co- precipitated with GiGet4 and GiGet5, as well as other proteins linked to Bag6 (TSPc, STI1/HOP, and several others), using streptavidin. This confirms that GiBag6 is a functional ortholog of metazoan Bag6. Additionally, it was shown that the addition of BAP-tag on GiBag6's C - terminus likely interrupts proper functioning of the protein. Immunofluorescent microscopy was also performed to localize GiBag6 in G. intestinalis, suggesting that GiBag6 is a cytosolic protein. Keywords: Giardia intestinalis, CRISPR, BAP-tag, Bag6

Abstakt Giardia intestinalis je tetraploidní prvok, který parazituje v lidském střevě. Patří do nadčeledi Excavata, k níž pravděpodobně patřil i LECA. U G. intestinalis byl nedávno identifikován protein GiBag6, o kterém se předpokládá, že je ortologem proteinu Bag6, jenž byl dosud považován za výlučně metazoický. Objev takového proteinu naznačuje prastarý původ Bag6, který možná sahá až k LECA. V této práci byl GiBag6 modifikován pomocí BAP-tagu na jeho N-konci s využitím systému CRISPR-Cas9, aby byla zajištěna nativní exprese. Následně byl pomocí streptavidinu koprecipitován s GiGet4 a GiGet5, stejně jako s dalšími proteiny spojenými s Bag6 (TSPc, STI1/HOP a několika dalšími). To potvrzuje, že GiBag6 je funkčním ortologem Bag6 u metazoí. Dále bylo prokázáno, že přidání BAP-tagu na C-konec GiBag6 pravděpodobně narušuje správnou funkci proteinu. Byla také provedena imunofluorescenční mikroskopie k lokalizaci GiBag6 v G. intestinalis, což naznačuje, že GiBag6 je cytosolický protein. Klíčová slova: Giardia intestinalis, CRISPR, BAP-tag, Bag6