Optimalizace podmínek pro sledování hydrolýzy proteinů pomocí kapilární elektroforézy s vysokorozlišovacím hmotnostním spektrometrem

Abstract

This diploma thesis focuses on the online coupling of capillary electrophoresis with high-resolution mass spectrometry for bioanalytical applications, specifically for the analysis of peptides formed during the enzymatic hydrolysis of proteins. The main aim of the thesis was the optimization of a CE-ESI-QTOF methodology for monitoring enzymatic protein hydrolysis, with emphasis on finding suitable background electrolyte composition, electrospray interface parameters, and ionization conditions leading to stable spray formation and high detection sensitivity. A newly installed Agilent 7100 capillary electrophoresis system coupled to an Agilent 6530 Q-TOF mass spectrometer through a sheath-flow interface was used in this work. The method optimization was performed using a model mixture of amino acids, while the influence of interface geometry, background electrolyte composition, ion source parameters, and sheath liquid composition on electrospray stability and signal intensity was investigated. Under optimized conditions, a tryptic digest of ovalbumin was subsequently analyzed. The acquired data were processed using MassHunter software, and peptide identification was carried out by database searching in the Mascot program utilizing the SwissProt database. The results confirmed that the coupling of...

Tato diplomová práce se zabývá on-line spojením kapilární elektroforézy s vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrií pro bioanalytické aplikace, konkrétně pro analýzu peptidů vznikajících enzymatickou hydrolýzou proteinů. Hlavním cílem práce byla optimalizace metodiky CE-ESI-QTOF pro sledování enzymatické hydrolýzy proteinů se zaměřením na nalezení vhodného složení základního elektrolytu, parametrů elektrosprejového rozhraní a podmínek ionizace vedoucích ke stabilnímu spreji a vysoké citlivosti detekce. Pro tuto práci byla využita nově instalovaná sestava kapilární elektroforézy Agilent 7100 spojená s hmotnostním spektrometrem Agilent 6530 Q-TOF prostřednictvím rozhraní s pomocnou kapalinou. Optimalizace metody byla provedena na modelové směsi aminokyselin, přičemž byl sledován vliv geometrie rozhraní, složení základního elektrolytu, parametrů iontového zdroje a složení pomocné kapaliny na stabilitu elektrospreje a intenzitu signálu. Za optimalizovaných podmínek byl následně analyzován trypsinový digest ovalbuminu. Získaná data byla zpracována softwarem MassHunter a identifikace peptidů byla provedena pomocí databázového vyhledávání v programu Mascot s využitím databáze SwissProt. Výsledky práce potvrdily, že spojení kapilární elektroforézy s vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrií představuje...