Development and characterization of synthetic antibody mimetics targeting fibroblast activation protein (FAP)

Abstract

3 Abstract Fibroblast activation protein (FAP) is a tumour-enriched serine protease predominantly expressed by cancer-associated fibroblasts within the tumour microenvironment, where it contributes to extracellular matrix remodelling and immunosuppression. This work aimed to develop and characterise cytotoxic N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide(HPMA)-based antibody mimetics, iBodies, for the specific targeting and elimination of FAP-expressing cells. Recombinant human FAP was successfully expressed and purified in an enzymatically active form, enabling functional evaluation of the polymer-drug conjugates in vitro. Targeted iBodies demonstrated nanomolar potency and specific binding in FAP-positive cell lines, while minimal engagement was observed in low-expression models. In contrast, anti-FAP antibodies targeted all FAP expressing cells, regardless of expression levels, highlighting iBody selectivity. Cytotoxicity assays revealed potent and target-dependent cell killing in FAP-overexpressing cells, though the specific effect was essentially absent in cells with endogenous FAP levels. Confocal microscopy further demonstrated rapid and target-dependent internalisation of iBodies in FAP-overexpressing cells, supporting their potential for intracellular delivery of cytotoxic payloads. Preliminary in vivo studies...

4 Abstrakt Fibroblastový aktivační protein (FAP) je serinová proteáza nadměrně produkovaná v nádorové tkáni, převážně nádorově asociovanými fibroblasty, kde se podílí na remodelaci extracelulárního prostředí a imunosupresi. Cílem této práce bylo vyvinout a charakterizovat cytotoxická polymerní mimetika protilátek na bázi N-(2-hydroxypropyl)methacrylamidu (HPMA), iBodies, pro specifické cílení a eliminaci buněk exprimujících FAP. Rekombinantní lidský FAP byl úspěšně připraven a purifikován v enzymaticky aktivní formě, což umožnilo funkční testování syntetizovaných polymerních konjugátů léčiv in vitro. Cílené iBodies vykazovaly nanomolární potenci a specifickou vazbu na buňky nadměrně exprimující FAP, zatímco v případě modelů s nízkou expresí byla vazba minimální. Na rozdíl od toho protilátka cílící na FAP byla schopna detekovat jak buňky s vysokou expresí, tak buňky s nižší expresí, čímž zdůraznila selektivitu iBodies. Testy cytotoxicity na buňkách s nadměrnou expresí FAP prokázaly výrazný a specifický účinek, nicméně v buňkách s přirozenou hladinou exprese FAP nebyl specifický cytotoxický efekt pozorován. Konfokální mikroskopie dále prokázala rychlou a specifickou internalizaci iBodies do buněk s vysokou expresí FAP a dokládá tak jejich potenciál pro intracelulární doručování cytotoxických látek. Předběžné...