Identification of novel targets of the nutrient sensing Rag GTPases

Abstract

The Rag GTPases are key regulators of amino acid sensing and mTORC1 activation at the lysosomal membrane, but the full range of proteins associated with their nutrient-sensing function remains uncertain. This thesis investigated whether the lysosomal membrane- associated proteins SLC35F6, TMEM55B, and the CLCN7-OSTM1 complex represent novel interaction partners of Rag GTPases. Candidate proteins were tested in HEK293T cells using co-immunoprecipitation and Western blot analysis under different detergent conditions and with active or inactive Rag complexes. Weak interaction signals were observed for all candidates in overexpression-based experiments, with TMEM55B and CLCN7-OSTM1 showing the most consistent, though still limited, association. Eventually, no strong direct interaction between recombinant proteins was confirmed and no clear interaction to endogenous Rag proteins was detected. These findings do not support the tested proteins as robust novel Rag interactors, but they suggest that TMEM55B and CLCN7-OSTM1 may merit further investigation using methods more suitable for detecting weak or transient membrane- associated interactions.

GTPázy Rag jsou klíčové proteiny regulující detekci aminokyselin a aktivaci mTORC1 na lysozomální membráně, avšak řada s nimi spojených proteinů podílejících se na detekci dostupnosti živin zůstává neznámá. Tato diplomová práce si klade za cíl zjistit, zda by lysozomální membránové proteiny SLC35F6, TMEM55B a proteinový komplex CLCN7- OSTM1 mohly představovat nové interakční partnery GTPáz Rag. Interakce těchto proteinů byly testovány v buněčné linii HEK293T v přítomnosti aktivních nebo inaktivních Rag komplexů a za různých detergentových podmínek pomocí koimunoprecipitace a Western blotu a. Při experimentech, které byly založeny na úměle zvýšené expresi proteinů, byly ve všech pokusech pozorovány slabé interakce, přičemž TMEM55B a CLCN7-OSTM1 je vykazovaly nejvíce konzistentně, i když stale v omezené míře. Žádná silná interakce nakonec nebyla potvrzena, a totéž platilo pro interakci rekombinantních proteinů neani s endogenními GTPázami Rag. Tyto výsledky nepotvrzují, že by testované proteiny byly novými interakčními partnery GTPáz Rag, naznačují však, že by bylo zajímavé podrobit TMEM55B a CLCN7- OSTM1 dalšímu zkoumání pomocí citlivějších metod vhodnějších pro detekci slabých nebo přechodných interakcí s membránovými proteiny.