Izolace a charakterizace RNA helikázy Gemin3

Abstract

This thesis focuses on the isolation and characterization of the human protein Gemin3, which is a key enzymatic component of the Survival of motor neuron (SMN) complex. This complex mediates the assisted assembly of the Sm ring onto small nuclear RNA (snRNA) during the biogenesis of small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs). Gemin3 belongs to the DEAD-box RNA helicase family, and its activity is believed to be essential for RNA structural rearrangements during this process. The aim of this study was to prepare this protein in its active form and experimentally verify its enzymatic properties in vitro. In the experimental part, the expression of the full-length protein was first tested in human HEK-293 cells. However, purification from this system yielded a low yield and showed a tendency for the protein to aggregate or oligomerize, which was confirmed by gel chromatography. Subsequently, the Gemin3 helicase domain was successfully purified in the Escherichia coli bacterial system, specifically in the wild-type form and two specific mutant variants (R140A and K112N) designed for the study of functional motifs. The main result of this work is the verification of ATPase activity in the isolated domains. In the K112N variant, which interferes with the binding site for adenosine triphosphate...

Tato diplomová práce se zabývá izolací a charakterizací lidského proteinu Gemin3, který představuje klíčovou enzymatickou složku SMN (z angl. survival of motor neuron) komplexu. Tento komplex zajišťuje asistované skládání Sm prstence na malé jaderné RNA (snRNA) během biogeneze malých jaderných ribonukleoproteinových částic (snRNP). Gemin3 patří do rodiny DEAD-box RNA helikáz a předpokládá se, že jeho aktivita je nezbytná pro strukturní přestavby RNA v průběhu tohoto procesu. Cílem práce bylo připravit tento protein v aktivní formě a experimentálně ověřit jeho enzymatické vlastnosti in vitro. V experimentální části byla nejprve testována exprese plnohodnotného proteinu v lidských buňkách linie HEK-293. Purifikace z tohoto systému však vykazovala nízký výtěžek a tendenci proteinu k agregaci či oligomerizaci, což bylo potvrzeno pomocí gelové chromatografie. Následně byla v bakteriálním systému Escherichia coli úspěšně purifikována helikázová doména Gemin3, a to ve formě divokého typu a dvou specifických mutantních variant (R140A a K112N) navržených pro studium funkčních motivů. Hlavním výsledkem práce je ověření ATPázové aktivity u vyizolovaných domén. U varianty K112N, zasahující do vazebného místa pro adenosintrifosfát (ATP), došlo k téměř úplné ztrátě hydrolytické aktivity. Varianta R140A,...