Separace diastereomerů krátkých oligonukleotidů v reverzním módu kapalinové chromatografie

Abstract

Short oligonucleotides, which may occur as metabolites of therapeutic oligonucleotides or as synthetic impurities, represent an important group of compounds from the perspective of bioanalytical monitoring. This diploma thesis focuses on the development and optimization of methods for their separation using reversed-phase liquid chromatography. The main focus was placed on the study of the retention behavior of short phosphorothioate (PS) 3-mer oligonucleotides and their diastereomers. The studied PS oligonucleotides differed in the number of PS modifications and in the type of nucleobase present in their structure. Parameters affecting retention, peak shape, and separation were investigated, especially the composition of the mobile phase, the type of stationary phase, separation temperature, and gradient elution program. The optimized conditions enabled efficient separation of the studied 3-mer PS oligonucleotides and their diastereomers and represent a suitable approach for their analysis. The optimal chromatographic conditions differed depending on the structure of the studied PS oligonucleotides. Key words oligonucleotide, diastereomer, separation, reversed phase liquid chromatography

Krátké oligonukleotidy, které mohou vznikat jako metabolity terapeutických oligonukleotidů nebo jako jejich syntetické nečistoty, představují významnou skupinu látek z hlediska jejich bioanalytického sledování. Tato diplomová práce se zabývá vývojem a optimalizací metod pro jejich separaci v reverzním módu kapalinové chromatografie. Hlavní důraz je kladen na studium retenčního chování krátkých fosforothioátových (PS) 3-mer oligonukleotidů a jejich diastereomerů. Testované PS oligonukleotidy se liší počtem PS modifikací a typem nukleobáze ve struktuře. Byly zkoumány parametry ovlivňující retenci, tvar píků a separaci, zejména složení mobilní fáze, typ stacionární fáze, separační teplota a gradientový eluční program. Optimalizované podmínky umožňují efektivní rozlišení sledovaných 3-mer PS oligonukleotidů a jejich diastereomerů a představují vhodný přístup pro jejich analýzu. Vhodné chromatografické podmínky se liší v závislosti na struktuře testovaných PS oligonukleotidů. Klíčová slova oligonukleotid, diastereomer, separace, reverzní mód, kapalinová chromatografie