Exprese genů pro nové enzymy mikrobiálního metabolismu aldoximů a nitrilů a charakterizace enzymových aktivit

Abstract

Disertační práce se zabývá mikrobiálním metabolismem aldoximů a nitrilů a jejich rolí v interakcích rostlin a mikroorganismů a současně biokatalytickým využitím aldoximdehydratas (Oxd) pro syntézu nitrilů nevyžadující kyanidy. Aldoximy vznikají v rostlinách z aminokyselin jako prekurzory obranných metabolitů (např. glykosidů a glukosinolátů) a mohou se uplatňovat i v signalizaci a stresové odpovědi. Mikroorganismy využívají aldoximy jako zdroj uhlíku a dusíku. Gen oxd se v genomech vyskytují v operonech s geny pro nitrilasy nebo nitrilhydratasy/amidasy a jejich produkty tvoří funkční aldoxim- nitrilovou dráhu, jejíž sekvenční diverzita výrazně převyšuje počet dosud biochemicky popsaných enzymů. Cílem práce bylo rozšířit znalosti o sekvenčním prostoru Oxd a charakterizovat nové enzymy se standardním i atypickým katalytickým centrem. Analýzou genomových databází, heterologní expresí a detailní enzymologickou charakterizací byly popsány dvě nové Oxd: bakteriální OxdBr1 z Bradyrhizobium sp. reprezentující novou rodinu enzymů se širokým substrátovým spektrem a fungální OxdFv z Fusarium vanettenii s neobvyklým motivem katalytického centra. Modelováním a mutagenezí jsme identifikovali klíčové determinanty aktivity a specificity. Praktický potenciál Oxd pro syntézy nitrilů byl ověřen vývojem kaskádového...

In the dissertation, microbial aldoxime and nitrile metabolism, plant-microbe interactions were investigated, and the biocatalytic use of aldoxime dehydratases (Oxd) for cyanide-free nitrile synthesis was developed. In plants, aldoximes are formed from amino acids as precursors of defensive metabolites (e.g. glycosides and glucosinolates) and may also contribute to signalling and stress responses. Microorganisms can utilize aldoximes as sources of carbon and nitrogen. In microbial genomes, Oxd genes often occur in operons together with genes encoding nitrilases or nitrile hydratases/amidases, thus forming a functional aldoxime- nitrile pathway whose supposed sequence diversity far exceeds the number of enzymes characterized biochemically to date. The aim of this work was to expand knowledge of the Oxd sequence space and to characterize novel enzymes with both canonical and atypical catalytic centres. Using genome database mining, heterologous expression, and detailed enzymological characterization, two new Oxd enzymes were described: the bacterial OxdBr1 from Bradyrhizobium sp., representing a new family with broad substrate scope, and the fungal OxdFv from Fusarium vanettenii, featuring an unusual catalytic triad. Through modelling and mutagenesis, key determinants of activity and specificity were...