Charakterizace sestřihových forem mRNA genů predisponujících ke vzniku dědičných nádorových onemocnění

Abstract

This study aimed to increase the efficiency and accuracy of molecular genetic diagnostics of hereditary cancer predispositions by implementing targeted RNA next- generation sequencing (RNA NGS) into routine laboratory practice. A methodology for parallel DNA/RNA NGS using the unified CZECANCA panel was developed, enabling direct assessment of the impact of germline variants on splicing and thus more accurate classification of variants of uncertain significance. An integral part of the workflow is a kinship analysis used to verify the identity of DNA/RNA sample pairs. As part of pre-analytical phase optimisation, a semi-automated protocol for RNA isolation from blood samples collected in Tempus™ tubes was established using the MagCore Plus II instrument. This approach reduced manual workload and improved result consistency. In addition, short-term lymphocyte expansion with optional inhibition of nonsense-mediated decay (NMD) was introduced, allowing detection of lowly expressed genes and unstable transcripts with premature stop codons. Tissue-specific expression analysis revealed that most cancer predisposition genes are expressed in at least one commonly available tissue (blood, skin, nasopharynx), and that the introduction of lymphocyte culturing significantly expanded the number of genes suitable...

Cílem práce bylo zvýšit efektivitu a přesnost molekulárně-genetické diagnostiky dědičných nádorových predispozic prostřednictvím zavedení cíleného RNA sekvenování nové generace (RNA NGS) do rutinního laboratorního provozu. Byla vyvinuta metodika paralelního DNA/RNA NGS s využitím jednotného panelu CZECANCA, která umožňuje přímé hodnocení dopadu germinálních variant na sestřih a tím i přesnější klasifikaci variant nejasného významu. Nedílnou součástí postupu je kinship analýza sloužící k ověření identity DNA/RNA párů. V rámci optimalizace preanalytické fáze byl vytvořen poloautomatizovaný protokol pro izolaci RNA ze vzorků krve odebrané do zkumavek Tempus™, využívající zařízení MagCore Plus II. Tento postup snížil náročnost manuální práce a zvýšil konzistenci výsledků. Současně byla zavedena krátkodobá expanze lymfocytů s možností inhibice mechanismu nonsense-mediated decay (NMD), která umožňuje detekci i málo exprimovaných genů a nestabilních transkriptů s předčasnými stop kodony. Analýza tkáňově specifické exprese ukázala, že většina nádorových predispozičních genů je exprimována alespoň v jedné z běžně dostupných tkání (krev, kůže, nosohltan), přičemž zavedená expanze lymfocytů významně rozšířila spektrum genů vhodných k analýze. Vyvinutá metodika RNA NGS byla následně aplikována na soubor...