Role of RACK1 protein in the regulation of apoptosis

Abstract

RACK1 (Receptor for Activated C Kinase 1) is a multifunctional scaffold protein involved in numerous signaling pathways, including stress responses and apoptosis. Its subcellular localization, particularly recruitment into stress granules (SGs) under cellular stress, may influence its ability to regulate apoptotic signaling. This study aimed to investigate how RACK1 expression levels affect apoptosis and to assess RACK1 localization, including mutant forms with reduced SG recruitment, under stress conditions. We generated RACK1 mutants designed to reduce localization into SGs and assessed their subcellular distribution using immunofluorescence. The mutants exhibited less SG localization compared to wild-type RACK1. To investigate the underlying mechanism, we performed co-immunoprecipitation to examine interactions with G3BP1, a core SG protein that may account for the differential localization. To evaluate the apoptotic response, the effects of RACK1 depletion and overexpression on stress kinase activity (JNK, ERK), Bcl-2 family protein expression, and caspase-3/7 activation were analyzed. RACK1 depletion reduced phosphorylation of JNK and ERK, suggesting diminished early pro-apoptotic signaling, yet simultaneously decreased anti- apoptotic Bcl-2 proteins and slightly increased pro-apoptotic Bcl-2...

RACK1 (Receptor for Activated C Kinase 1) je multifunkční adaptorový protein zapojený do řady signálních drah, včetně stresových odpovědí a apoptózy. Jeho subcelulární lokalizace, zejména translokace/přesun do stresových granulí (SG) během buněčného stresu, může ovlivnit jeho schopnost regulovat apoptotické signální dráhy. Cílem této práce bylo prozkoumat, jak za stresových podmínek hladina exprese RACK1 ovlivňuje apoptózu a analyzovat lokalizaci RACK1 a jeho mutantních forem s omezenou lokalizací do SG. Navrhli jsme mutantní varianty RACK1 tak, aby byla snížena jejich lokalizace do SG. Za použití imunofluorescenční mikroskopie jsme potvrdili, že mutantní proteiny vykazovaly výrazně nižší lokalizaci do SG ve srovnání s buňkami exprimujícími wild-type RACK1. Pro prozkoumání mechanismu rozdílné lokalizace jsme provedli ko-imunoprecipitaci a zkoumali interakce s G3BP1, esenciálním proteinem SG, které by mohly vysvětlit rozdílnou lokalizaci mezi RACK1 WT a mutantním RACK1 proteinem. Pro zhodnocení apoptotické odpovědi jsme analyzovali vliv deplece a zvýšené exprese proteinu RACK1 na aktivitu stresových kináz (JNK, ERK), expresi proteinů rodiny Bcl-2 a aktivaci kaspáz 3/7. Deplece RACK1 vedla ke snížení fosforylace JNK a ERK, což naznačuje oslabení raného pro-apoptotického signálu, současně však došlo...