Characterization of the enzymes involved in the de novo purine nucleotides biosynthesis in Mycobacterium smegmatis

Abstract

Purine compounds are ubiquitous metabolites involved in cellular processes, such as energy transduction, signalling, and nucleic acid synthesis. They are produced either through the de novo pathway, which converts 5-phosphoribosylpyrophosphate (PRPP) into inosine monophosphate (IMP) via 11 enzymatic steps, or through the salvage pathway. In Escherichia coli and Bacillus subtilis, de novo purine nucleotide biosynthesis is regulated by PurR repressor, and B. subtilis also employs a guanine riboswitch. In mycobacteria, however, no repressor or riboswitch motifs have been identified, and the regulatory mechanism remains unclear. To better elucidate purine metabolism in Mycobacterium smegmatis, deletion mutants ΔpurF, ΔpurD, ΔpurN, ΔpurL, ΔpurM, ΔpurKE, ΔpurC, ΔpurB, and ΔpurH were constructed. Their phenotypic analysis revealed position-dependent growth defects and distinct substrate utilisation patterns. Early-pathway mutants upstream of aminoimidazole ribonucleotide (AIR) formation (ΔpurD, ΔpurL, ΔpurM) showed pronounced thiamine-dependent growth due to the metabolic intersection of purine and thiamine biosynthesis. Additionally, disruption of de novo purine nucleotide biosynthesis impaired biofilm development across most mutants. Complemented strains expressing His-StrepII-tagged Pur enzymes were...

Purinové sloučeniny jsou všudypřítomné metabolity zapojené do buněčných procesů, jako je přenos energie, signalizace a syntéza nukleových kyselin. Vznikají buď de novo drahou, která přeměňuje fosforibosylpyrofosfát (PRPP) na inosin monofosfát (IMP) prostřednictvím 11 enzymatických kroků, nebo salváží, při níž jsou puriny recyklovány a vzájemně přeměňovány. U Escherichia coli a Bacillus subtilis je de novo biosyntéza purinů regulována represorem PurR a B. subtilis navíc využívá guaninový riboswitch. U mykobakterií však nebyl identifikován žádný represor ani riboswitch motivy a regulační mechanismus tak zůstává nejasný. Za účelem lepšího objasnění purinového metabolismu u Mycobacterium smegmatis byly připraveny deleční mutanty ΔpurF, ΔpurD, ΔpurN, ΔpurL, ΔpurM, ΔpurKE, ΔpurC, ΔpurB, a ΔpurH. Jejich fenotypová analýza odhalila na pozici závislé růstové defekty a odlišné vzorce využívání substrátů. Mutanti blokovaní v raných krocích před tvorbou aminoimidazol- ribonukleotid (AIR) (ΔpurD, ΔpurL, ΔpurM) vykazovali výraznou závislost na thiaminu v důsledku metabolického propojení syntézy purinů a thiaminu. Dále se ukázalo, že narušení de novo syntézy purinů negativně ovlivňuje tvorbu biofilmu u většiny mutantů. Pro studium možné regulace na úrovni proteinů byly připraveny komplementační kmeny exprimující...