Pharmacological and Phenotypic Screen of New Therapeutically Relevant Calcium Channel Modulators

Abstract

Vápníkové kanály typu T disponují jedinečnými elektrofyziologickými vlastnostmi (Cav3.1, Cav3.2 a Cav3.3), jimiž řídí nervovou excitabilitu a hrají důležitou roli v mnohých fyziologických procesech. Dysregulace a genetické mutace kanálů typu T jsou spojeny s řadou neurologických a neurovývojových onemocnění. Porozumění strukturně-funkčních vlastností kanálů typu T a jejich molekulárním mechanismům, jimiž přispívají k buněčné fyziologii a patofyziologii, je zásadní pro navrhování nových terapeutických strategií. Studie navíc ukázaly, že farmakologická modulace představuje slibný přístup k léčbě patologií spojených s kanály typu T. Hlavním cílem této disertační práce bylo využití automatického patch-clampu (APC) pro screening nových terapeuticky relevantních modulátorů kanálů typu T v rámci knihovny peptidů z pavoučích jedů. Screening vedl k objevu nového, vysoce účinného a selektivního peptidového toxinového inhibitoru kanálů typu T, jehož funkci jsem validoval jak v rekombinantních, tak v nativních podmínkách. S důrazem na farmakologii jsem následně použil manuální patch-clamp (MPC) k vyšetření série racionálně navržených malých organických molekul s inhibiční aktivitou vůči kanálům typu T. Touto strategii jsem identifikoval potentní sloučeninu a ověřil její analgetickou účinnost v preklinických...

Through their distinct electrophysiological properties, T-type calcium channels (encoded by three isoforms Cav3.1, Cav3.2 and Cav3.3) shape neuronal excitability and are essential components of many physiological processes. More importantly, dysregulation and genetic mutations of T-type channels have been associated with several neurological and neurodevelopmental disorders. Understanding the structure- function of T-type channels and the molecular mechanisms, by which these channels contribute to cellular physiology and pathophysiology, is important for designing novel strategies for therapy. Moreover, studies have shown that pharmacological modulation represents a promising approach for the treatment of T-type channel- related pathologies. As the principal aim of this dissertation thesis, I used automated patch-clamp electrophysiology (APC) as a high-throughput screening platform to screen for novel modulators of T-type channels amongst a library of spider venom peptides. The pharmacological screen led to the discovery of a novel potent and subtype-specific peptide toxin inhibitor of T-type channels, which I functionally validated in both recombinant and native conditions. Next, expanding this pharmacological approach, I used manual patch-clamp electrophysiology (MPC) to evaluate a series of...