Development of enzymatic reactors and their implementation in structural proteomics.

Abstract

5 ABSTRACT (IN ENGLISH) Mass spectrometry (MS) has become indispensable in structural biology, enabling not only protein identification and quantification but also the investigation of higher-order structure and conformational dynamics. Among structural MS techniques, hydrogen/deuterium exchange MS (HDX-MS) holds a unique position due to its ability to probe protein flexibility and dynamics in solution. This doctoral thesis focused on the development and optimization of sample processing workflows in HDX-MS, particularly proteolytic strategies tailored for challenging targets such as highly stable antibodies, heavily modified proteins, membrane-associated proteins, and sequences resistant to conventional proteases. Special attention was given to the prolyl endopeptidase AnPEP, evaluated for online digestion. During this work, a previously unrecognized preference for reduced cysteine residues was discovered, a feature later identified as a common trend in a whole class of post- proline cleaving enzymes. The potential of immobilized AnPEP, either alone or in combination with other acidic proteases, was then demonstrated on the proline-rich prion protein. In parallel, additional immobilized protease columns, comprising single or mixed acidic proteases, were tested for the digestion of therapeutic antibodies....

6 ABSTRAKT (IN CZECH) Hmotnostní spektrometrie se stala nepostradatelným nástrojem ve strukturní biologii, neboť umožňuje nejen identifikaci a kvantifikaci proteinů, ale rovněž studium jejich prostorového uspořádání a dynamiky. Mezi strukturními MS technikami zaujímá vodík/deuteriová výměna spojená s hmotnostní spektrometrií (HDX-MS) výjimečné postavení, neboť umožňuje zkoumat flexibilitu a dynamiku proteinů v roztoku. Tato disertační práce byla zaměřena na vývoj a optimalizaci přípravy vzorků v rámci HDX-MS, zejména na proteolytické strategie vhodné pro obtížně analyzovatelné proteiny. Patří sem vysoce stabilní protilátky, modifikované proteiny, membránové proteiny a sekvence odolné vůči standardně používaným proteasam. Zvláštní pozornost byla věnována prolyl endopeptidase AnPEP. V průběhu studia byla objevena dosud nepopsaná preference této proteasy pro redukovaný cystein, což se později potvrdilo jako obecný trend celé skupiny enzymů štěpících za prolinem. Potenciál imobilizované AnPEP proteasy, ať už samostatně nebo v kombinaci s jinými kyselými proteasami, byl následně prokázán na prionovém proteinu s vysokým obsahem prolinu. Paralelně byly testovány další proteolytické kolony, obsahující jak jednotlivé, tak směsi kyselých proteas, pro štěpení terapeutických protilátek. Zde současně probíhala podrobná...